響應面優化普魯蘭酶酶解玉米淀粉工藝研究

曹川 解鵬

摘?要：研究普魯蘭酶對蠟質玉米淀粉脫支工藝的影響.?以還原力（DE）為考察指標，探討pH、溫度、加酶量和酶解時間對玉米淀粉脫支的影響，采用響應面法對酶解過程中的工藝參數進行優化.研究結果表明，在玉米淀粉脫支工藝單因素試驗中最適的酶解條件是：pH?5.0，溫度50℃，加酶量7.2?U/g，酶解時間12?h;最佳酶解條件為：pH?5.3，加酶量8.1?U/g，溫度50℃.最佳條件下得到的?DE為0.57，較單因素試驗的DE高，證明此優化條件能較好地提高蠟質玉米淀粉的脫支程度.

關鍵詞：普魯蘭酶;脫支;響應面

[中圖分類號]TS234?[文獻標志碼]A

Response?Surface?Methodology?for?Optimization?of?HydrolysisConditions?for?Corn?Starch?by?Pullulanase

CAO?Chuan1，2，XIE?Peng3

（1.College?of?Tea?and?Food，Anhui?Agricultural?University，Hefei?230001，Anhui，China;2.Department

of?Grain?Engineering，Anhui?Vocational?College?of?Grain?Engineering，Hefei?230011，Anhui，China;

3.Nanjing?University?of?Finance?and?Economics，Collaborative?Innovation?Center?for?Modern

Grain?Distribution?and?Safety，Nanjing?210046，China）

Abstract：To?research?the?effect?of?pullulanase?on?waxy?corn?starch?debranching?process.The?effect?of?enzyme?dosage，pH，temperature?and?time?on?the?enzymatic?hydrolysis?of?waxy?corn?starch?was?investigated?with?the?release?rate?of?reducing?sugar?（?DE）?as?the?index.The?response?surface?methodology?was?used?to?optimize?the?process?parameters?in?the?enzymolysis?process.Results：The?optimum?enzymolysis?conditions?of?waxy?corn?starch?pulullanse?content?of?7.2?U/g，temperature55℃，enzyme?solution?pH?5.0，enzymatic?hydrolysis?time?12?h;Response?surface?analysis?determined?the?optimal?enzymatic?conditions?were?pH?5.3，the?amount?of?enzyme?added?8.1?U/g?and?the?temperature?50?℃.Under?the?optimal?conditions?DE?is?0.57，which?is?higher?than?that?of?the?single?factor?test.It?is?proved?that?this?optimization?condition?can?better?improve?the?debranching?degree?of?waxy?corn?starch.

Key?words：pullulanse;debranched;Box-Behnken

普魯蘭酶（Pullulanase，?EC?3.2.1.41）是一種脫支酶，作為外切酶，能夠專一性的切割葡萄糖的α-1，6糖苷鍵，應用于淀粉的脫支.脫支程度的增加使鏈重新結合形成新的晶體結構，從而形成更多的抗性淀粉.[1]Berry[2]報道了用普魯蘭酶對馬鈴薯支鏈淀粉進行脫支處理，使其RS3含量顯著增加.Selime?Mutlu[3]利用響應面法（RSM）模擬脫支和微波輻照對高直鏈玉米淀粉性能的影響，將微波處理和酶改性方法與RSM模型相結合，有助于確定高抗性淀粉（RS）含量和低體外血糖指數值的最佳處理點.本文以蠟質玉米淀粉為原料，通過普魯蘭酶進行淀粉脫支工藝研究，確定最佳的酶解條件，通過脫支生成線性短鏈淀粉，改善淀粉凝膠性能，提高分子聚集纏結能力和淀粉抗酶解能力，增強淀粉的流動性和壓實性能，為淀粉基包埋產物緩慢釋放提供參考依據.

1?材料與方法

1.1?供試材料

材料?玉米淀粉，蘇州君世科技化工科技有限公司.

儀器?LP202A型電子天平（江蘇常熟市衡器廠），超聲波清洗機（昆山超聲波儀器）;恒溫水?。ê贾莼轄杻x器），?TLXJ-IIC臺式冷凍高速離心機（上海安亭科學有限公司），T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），DF-1集熱式磁力攪拌器?（上海汗諾儀器有限公司），HY-5型振蕩器（常州國華儀器設備公司）.

試劑?氫氧化鈉、葡萄糖、碘液、無水乙醇、二甲基亞砜、苯酚、二硝基水楊酸、酒石酸鉀納、亞硫酸氫鈉等，購自上海國藥集團.普魯蘭酶，美國Sigma?公司.

1.2?脫支淀粉的制備

脫支淀粉的制備參考?Cai?和Liu的方法.[4]將一定質量的蠟質玉米淀粉置于500mL?0.01mol/L醋酸鈉緩沖液（pH5.0）中，制備10%乳液，磁力攪拌器在95℃條件下攪拌30min.調節pH，高壓蒸汽121℃，30min，完全糊化.置于沸水浴中攪拌10min，當淀粉糊的溫度降至50℃時，加入普魯蘭酶進行脫支12h.脫支結束后，100℃煮沸滅酶10min，無水乙醇定容至1?000mL.離心機離心收集沉淀物，冷凍干燥，過篩100目，最后得到脫支的蠟質玉米淀粉.

1.3?測定項目及分析方法

單因素試驗?淀粉的脫支程度由還原力DE值決定，采用二硝基水楊酸法（DNS）在540nm處測量樣品的吸光度.以DE為衡量指標，分別對加酶量、pH、溫度和酶解時間進行試驗測定，得出各個因素對蠟質玉米淀粉DE的變化趨勢圖.

酶解工藝條件的優化及響應面分析?為獲得蠟質玉米淀粉最佳脫支條件，對酶解條件進行優化，根據單因素試驗結果確定因素水平，通過Box-Behnken試驗設計確定最佳工藝條件.

酶解優化試驗因素和水平?通過中心復合試驗設計對溫度、pH和酶用量三個因素進行優化.以脫支后上清液中DE的變化作為響應值，三個自變量pH、溫度和加酶量分別用A，B，C代表，結果見表1.采用origin8.0軟件對數據進行處理，作折線圖進行比較，用SPSS22.0軟件對數據進行統計學分析，顯著水平為P<0.05.

2?結果與分析

2.1?蠟質玉米淀粉脫支單因素試驗結果與分析

普魯蘭酶用量對蠟質玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質玉米淀粉溶液糊化完全，調節pH為5.0，分別加酶量1.8，3.6，?5.4，7.2，9.0U/g，置于50℃下酶解12h.結果見圖1.由圖1可知，當普魯蘭酶添加量較少時，分子被切斷程度不夠，淀粉未完全脫支;添加量太大，蠟質玉米淀粉已經基本酶解完全，底物已經耗完，再增加酶用量對DE值的影響不大.考慮到經濟效益和酶解效果，選擇加酶量為7.2U/g.

pH對蠟質玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質玉米淀粉溶液糊化完全，加酶量為7.2U/g，分別調節pH為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，置于50℃水浴下酶解12h.結果見圖2.酶與底物的結合能力和催化能力受到pH影響，由圖2可以看出，pH4.0～5.0時DE值隨著pH的上升而增加，pH大于5.0后，DE值反而隨著pH值的升高而下降.因此，酶解的最適宜pH是5.0.

溫度對蠟質玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質玉米淀粉溶液糊化完全，調節pH為5.0，加酶量為7.2U/g，分別置于45，50，55，60，65℃水浴下酶解12h.結果見圖3.圖3表明，最佳反應溫度是50℃，溫度會影響酶的催化效率[5]，普魯蘭酶作用溫度過高過低都不利于淀粉的脫支.在45～50℃隨著溫度增加DE值增加，超過50℃，隨著脫支溫度的增加，普魯蘭酶的活性降低或者因過高溫度普魯蘭酶失活，DE下降.

酶解時間對蠟質玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質玉米淀粉溶液糊化完全，調節pH為5.0，加酶量為7.2U/g，置于50℃水浴下分別酶解3，6，9，12，24，48h.結果見圖4.由圖4可知，隨著酶解時間的延長，酶與底物的接觸和反應越來越充分，普魯蘭酶作用時間在0～24?h曲線上升，普魯蘭酶作用時間為12h時，曲線上升到最高點.酶是緩慢作用于支鏈淀粉專一切開α-1，6糖苷鍵，脫支時間大于12h時，蠟質玉米淀粉的支鏈部分已基本被切開，蠟質玉米淀粉的脫支程度不再隨著時間的增加而顯著增加.

2.2?響應面優化結果與分析

利用Design?Expert?8.0對試驗進行處理分析，回歸方程的方差分析、參數估計及顯著性分析結果見表2.

利用Design?Expert?8.0軟件對數據進行二次多元回歸擬合方程：

還原力DE=55.04-0.79*A+0.61*B+1.51*C+0.15*A*B+7.500E-003*A*C-0.39*B*C-5.61*A²-3.86*B²-7.15*?C².

二次回歸模型的F值為127.73，P<0.000?1，

大于在0.01水平上的F值;失擬項的F值為3.22，失擬項不顯著，說明該模型擬和結果好，BC的交互作用對DE有顯著的影響.模型與試驗擬合效果較好，可用于對試驗結果進行分析.利用Design?Expert?8.0軟件對數據進行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應曲面圖[6]見圖5-7.

由圖5可知，pH和溫度增加時，DE先升高后降低，等高線形狀橢圓形，pH與溫度的交互作用對反應有顯著影響.[7]由圖6和圖7可知，還原力DE先勻速上升后迅速下降，響應面比較陡峭，說明DE對加酶量、溫度、pH的變化敏感.為了進一步求得各因素的最佳條件組合，通過對模型方程的求解，得到曲面的最大值.對回歸方程求導，并令其等于零，可以得到曲面的最大點，即3個主要因素的最佳水平值，轉換后得到提取的最佳條件為A=5.34，B=49.86，C=8.18.為檢驗響應曲面的可靠性，采用上述優化條件進行試驗[8]，對試驗結果進行驗證.考慮到實際操作的便利，將酶解工藝參數修正為：pH5.3，溫度50℃，加酶量8.10U/g，該條件下得到的DE分別為0.572?4，0.571?3，0.570?1，0.572?3，0.571?9，0.572?1，平均值為0.571?7，偏差不大，保持在0.57的水平，證明該結果是合理可靠的.

3?結果與討論

采用單因素試驗，確定酶解的pH、時間、溫度和加酶量的最優條件.通過響應曲面法的優化，證明DE與3個關鍵因子（加酶量，溫度，pH）的二次多項回歸模型是合理可靠的.利用Design?Expert軟件對關鍵因子及其相互作用進行分析，得出酶解最佳條件：pH為5.3，加酶量為?8.1U/g，溫度為?50℃，該條件下得到的蠟質玉米淀粉的還原力0.57以上.該研究可以為有效科學地利用淀粉脫支工藝將脫支淀粉應用于包埋運載藥物及活性物質等，提供重要的技術基礎.

參考文獻

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[2]Berry?CS.Resistant?starch：Formation?and?measurement?of?starch?that?survives?exhaustive?digestion?with?amylolytic?enzymes?during?the?determination?of?dietary?fibre[J].Journal?of?Cereal?Science，1986（4）：301-304.

[3]Selime?Mutlu，Kevser?Kahraman，Sebnem?Severcan，Serpil?O··ztürk.Modelling?the?Effects?of?Debranching?and?Microwave?Irradiation?Treatments?on?the?Properties?of?High?Amylose?Corn?Starch?by?Using?Response?Surface?Methodology[J].Food?Biophysics，2018（9）：263-273.

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[5]彌春霞，代志平，楊蕾.?酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定[J].牡丹江師范學院學報：自然科學版，2007（3）：35-36.

[6]曹川，包建強.響應面法優化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究[J].食品工業科技，2012，33（5）：258-261.

[7]王茜，王啟之，時維靜，等.響應面法與正交設計法優化黃蜀葵總黃酮閃提工藝比較[J].安徽科技學院學報，2015，29（5）：24-31.

[8]黃艷勝.溫度對玉米種子萌發能力的影響[J].牡丹江師范學院學報：自然科學版，2007（1）：23-24.

編輯：琳莉

收稿日期：2019-12-01

基金項目：安徽省科技攻關項目（1704a07020098）;?2016年高等學校省級質量工程項目（?2016jxtd038）

作者簡介：曹川（1988-），女，安徽肥西人.講師，博士，主要從事糧食儲藏與檢測科研;解?鵬（1988-），男，安徽肥西人.博士，主要從事糧食流通領域研究.