轉移性直腸腺癌潛在生物標志物的鑒定

馬秀坤 洪洙 劉翔龍 華揚

(1天津市中醫藥研究院附屬醫院外科，天津 300120；2天津市人民醫院肛腸中心)

直腸腺癌(RAC) 是直腸癌中一種主要的組織學類型，具有相當高的死亡率和病發率，5年總體的存活率為66.5%〔1～4〕。對于早期RAC患者來說，手術切除是唯一的治療方法。對于局部中晚期RAC患者，手術與術前輔助放化療結合能夠提高患者的5年總存活率〔5〕。雖然術前放療可有效降低RAC的再發生率，但尚未有研究證明其能改善患者的整體預后，大多數情況下治療的失敗最終都源自遠端轉移〔6～8〕。據報道遺傳易感性、基因失調、吸煙和肥胖之間的多因素交叉可能導致RAC的進展〔4〕。有研究表明miR-144通過靶向Rho關聯含卷曲螺旋結合蛋白激酶(ROCK)-1抑制直腸癌細胞的遷移和增殖〔9〕，miR-19a能夠介導腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的由內皮細胞向間葉細胞的轉移過程〔10〕。在中國漢族人群中，磷脂酶Cε1基因(PLCE1)的多態性也與結直腸癌的發病風險有關〔11〕。韓國患者中，RAN rs14035、DICER1 rs3742330、核輸出蛋白(XPO)5 rs11077、DROSHA rs10719的變化與患結腸直腸癌的風險顯著相關〔12〕。但是目前針對RAC的發生發展及轉移的病理機制還尚不清楚。本研究采用生物信息學方法，將腫瘤基因組圖譜計劃(TCGA)數據庫中RAC的mRNA表達數據進行整合并按照RAC轉移患者與未轉移患者進行分類，探討RAC轉移的發病機制并確定RAC轉移的診斷生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1從TCGA數據庫下載有無轉移的RAC患者的mRNA基因表達譜 TCGA數據庫中共有171例RAC患者的數據可用。從TCGA數據門戶(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)獲取RAC患者的臨床記錄(截至2015年4月7日)和基因表達譜。RAC患者的基因表達譜在本研究中的納入標準如下：(1)屬于RAC患者的原發性腫瘤；(2)患者沒有惡性腫瘤史；(3)患者在收集腫瘤樣本前未接受任何治療。最終共有150例患者的基因表達譜納入本研究，并根據美國癌癥聯合委員會腫瘤分期(AJCC TNM)系統將患者分為轉移組和非轉移組〔1〕。基因表達譜的數據集分別基于IlluminaHiSeq RNASeqV2和IlluminaGA RNASeq。

1.2RAC患者轉移組與非轉移組間的差異表達基因分析 下載納入本研究的RAC患者的三級表達數據，采用R語言的DESeq2包在轉移組和非轉移組之間分別篩選出3個數據集中的失調基因〔13〕。在3個數據集中，重疊失調基因被識別為與RAC轉移相關的差異表達基因(DGEs)。計算DEGs顯著性的P值并采用斯托弗(Stouffer Z-score)方法結合P值〔14〕。采用偽發現率 (FDR) 對原始P值進行多次測試校正并將DEGs的閾值設為FDR<0.05〔15〕。兩組間DEGs均進行熱圖分析，用于評價兩樣本間基因表達模式的相似性。熱圖是用R語言中的pheatmap包構建的〔16〕。

1.3基因功能注釋 為了獲得DEGs的生物學作用和信號通路，利用在線軟件BinGo和GeneCodis3進行基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)的通路富集〔17，18〕。FDR<0.05是篩選顯著富集GO功能和KEGG通路的閾值。

1.4蛋白-蛋白相互作用 為了深入了解與RAC轉移相關的DEGs之間的相互作用，利用已知和預測蛋白相互作用的數據庫BioGRID構建了蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI)〔19〕，然后用Cytoscape軟件 (http：//cytoscape.org/)對PPI進行可視化〔20〕。

1.5實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 為了驗證DEGs在轉移組和非轉移組之間的表達水平，對收集的RAC腫瘤組織進行qRT-PCR檢測。采用Ⅲ逆轉錄試劑盒(Invitrogen，CA，USA)合成cDNA，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems，Foster City，CA)在Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems，Foster City，CA)上進行qRT-PCR反應。β-actin作為內源性控制基因，將每一項測驗重復3次，并用CT法計算基因的相對表達量〔21〕。所用引物如表1所示，使用GraphPad Prism6.0版軟件包(GraphPad software，San Diego，CA，USA)輸出實驗結果圖。

表1 qRT-PCR檢測中的基因引物

2 結 果

2.1與RAC轉移相關的DEGs的鑒定 150例RAC患者中，分別有70例納入轉移組和80例納入非轉移組。RNASeq UNC IlluminaGA_RNASeq平臺轉移29例，非轉移43例；RNASeqV2 UNC IlluminaHiseq_RNASeqV2平臺轉移41例，非轉移37例。轉移組和非轉移組共發現67個DEGs，其中上調DEGs 50個，下調DEGs 17個。如表2所示，結直腸癌相關蛋白1(C11orf92)、Kelch樣家族成員(KLHL)32、程序性細胞死亡蛋白1配體(CD274)為顯著上調的DEGs；神經外營養蛋白(NXPH)4、細胞周期蛋白(CCN)D3、載脂蛋白(APO)D為明顯下調的DEGs。

2.2DEGs的功能注釋 為探討經鑒定的DEGs在RAC轉移中的功能意義，對67個DEGs進行GO功能和KGGG富集分析。在生物響應過程中發現，維生素D對細胞色素P450家族24亞家族A成員(CYP24A)1、磷脂酶A2組IVA(PLA2G4A)和水通道蛋白(AQP)3有顯著的富集作用 (圖1A，表3)。醛脫氫酶1家族成員(ALDH1)A2、APOD、細胞視黃酸結合蛋白(CRABP)2在類維生素A結合分子功能上顯著富集 (圖1B，表3)。此外，GO術語的細胞注釋中沒有出現DEGs的富集。胰腺分泌(hsa04972)和細胞黏附分子(hsa04514)是顯著富集的通路(表3)。

2.3PPI 如圖2所示，網絡由494個節點，479條邊組成。本研究將與基因連接度高的節點定義為樞紐蛋白，并將與基因連接度簡稱為degree。CCND3 (degree=48)、CD274 (degree=46)和泛素相關結合域蛋白(UBAC)2(degree=45)是PPI網絡中最重要的3個樞紐蛋白。

2.4通過qRT-PCR驗證DEGs的表達水平 為了驗證通過TCGA數據集的生物信息學分析鑒定出的RAC轉移中的DEGs，采用qRT-PCR方法對5例RAC轉移患者的原發腫瘤組織和5例未轉移的原發腫瘤組織中DEGs的表達水平進行定量分析。見表4，RAC轉移組的CCND3、AQP3、父系表達蛋白(PEG)10、RAB27B較非轉移組有上調趨勢。編碼腺苷酸環化酶(ADCY)1在RAC轉移組較非轉移組有下調趨勢。

表2 與直腸腺癌轉移相關的前10位上調DEGs和 下調DEGs

A.DEGs的生物反應過程富集；B.DEGs的分子功能性富集。灰色節點表示DEGs的富集的GO術語圖1 通過BINGO軟件對DEGs進行GO富集

表3 DEGs在RAC轉移中的功能注釋

名稱術語數目FDR基因KEGG 通路hsa04972胰腺分泌30.041ADCY1,RAB27B,PLA2G4Ahsa04514細胞黏附分子(CAMs)30.041NRCAM,CLDN18,CD274GO 富集-生物過程33280維生素D反應30.023CYP24A1,PLA2G4A,AQP3GO 富集-分子功能5501維生素A類結合30.017ALDH1A2,APOD,CRABP219840類異戊二烯結合30.017ALDH1A2,APOD,CRABP2

白色和灰色節點分別代表上調和下調DEGs，黑色節點代表與DEGs相互作用的基因產物。實線表示兩種蛋白質之間的相互作用。節點大小代表DEG在RAC表達的顯著程度，節點越大表示該DEG在RAC表達越顯著圖2 67個失調DEGs的PPI

表4 qRT-PCR方法驗證候選基因的表達

3 討 論

CCND3位于染色體6p21，編碼cyclin D3，屬于高度保守的cyclin家族。CCND3是PPI網絡中的樞紐蛋白。由于細胞周期蛋白D1對細胞周期中G1/S期會產生影響，通過此特性發現其參與了包括結直腸腺癌(CRC)、非小細胞肺癌和胃癌在內的多種癌癥的進展〔22～24〕。在結腸直腸癌的肝轉移發展過程中，CCND3升高與血管浸潤和肝轉移相關，降低了疾病特異性生存率〔22〕。與結腸直腸癌的原發性病變相比，肝臟轉移灶中的CCND3明顯上調〔25〕。結腸癌和直腸癌的基因表達譜存在差異，表明個體發育也存在差異性〔26〕。目前尚無CCND3在結腸直腸癌的進展和轉移中的生物學作用研究。

本研究中，與非轉移組相比，AQP3在RAC轉移過程中表達上調，并在生物過程中對維生素D的反應中富集。AQP3參與細胞的攻擊性、侵襲性和遷移，在結腸癌、胃癌、食管鱗癌、胰腺癌等多種癌癥中均有升高〔27～30〕。AQP1、AQP3、AQP5過高水平的表達與結腸癌淋巴結轉移顯著相關〔28〕。上調AQP3促進胃癌上皮間充質轉化，與胃癌細胞遷移、侵襲性及預后不良相關〔27〕。表皮生長因子促使AQP3上調，上調的AQP3可通過表皮生長因子受體(EGFR)/細胞外信號調節激酶(ERK)途徑促進胰腺癌細胞遷移〔29〕，這是首次關于AQP3在RAC轉移過程中發生異常的報道，尚需進一步研究。

PEG10，一類父系表達基因，在RAC轉移中出現顯著上調 。PEG10的異位過量表達通過上調E-cadherin的表達并抑制乳腺癌和肺癌中基質金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9的表達，進而促進細胞增殖、遷移和侵襲〔30～32〕。在肝細胞癌中，PEG10的表達與總體生存和腫瘤復發的不良預后有關〔33〕。PEG10在結腸直腸癌類型和RAC的進展和轉移中的作用尚不清楚。綜上所述，PEG10的過量表達可能在RAC轉移中發揮重要作用。

RAB27B是RAS致癌基因家族成員。RAB27B在結腸直腸癌中的作用存在爭議，因為研究報道其上調和下調均與結腸直腸癌的轉移和預后不良相關〔34，35〕。有報道顯示RAB27B的表達明顯高于實驗中與其匹配的非癌組織，表明其表達與淋巴結轉移、遠處轉移和結腸直腸癌TNM分期相關〔35〕。研究表明，RAB27B的陰性表達與CRC中腫瘤分化不良、血管浸潤陽性顯著相關〔34〕。在本研究中，RAB27B在結腸直腸癌轉移中出現上調。RAB27B表達異常與RAC轉移的相關性分析還需要通過大樣本的RAC患者進行臨床實踐。

ADCY1是腺苷酸環化酶基因家族的一員。據報道ADCY1在膠質母細胞瘤中被高度甲基化〔36〕。ADCY1的下調在RAC中的生物學作用還有待闡明。RAC中失調的ADCY1和RAB27B在胰腺分泌通路中出現顯著富集。通過比較RAC轉移組與非轉移組得到的67個DEGs的研究分析表明胰腺分泌和細胞黏附分子通路顯著富集。

綜上所述，CCND3是網絡中的樞紐蛋白，ADCY1可能通過胰腺分泌和細胞黏附分子途徑，與AQP3、PEG10、RAB27B一起在RAC的轉移和侵襲過程中發揮關鍵作用。這些研究發現可能為RAC提供有價值的預后指標和治療靶點。本研究是在RAC中首次基于RAN-seq數據進行綜合分析的報告。這些DEGs和通路在RAC轉移中的作用還需要進一步的實驗來研究。