丁苯酞對慢性酒精中毒大鼠內質網應激相關基因的影響

董家行 姜萬舉 劉佳聰 朱甲婧 張占蕊 張瑞嶺 杜愛林

(1新鄉醫學院生理學與神經生物學教研室 中英腦功能損傷聯合實驗室 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地，河南 新鄉 453003；2新鄉醫學院第二附屬醫院 河南省生物精神病學重點實驗室)

慢性酒精中毒在全世界許多國家都是一個社會性健康難題，據調查，我國約4.7%的成年居民存在過量飲酒的狀況，很多地區都存在著酒精濫用的現象，對社會生產力的穩定發展造成了較大的威脅〔1〕。慢性酒精中毒患者會出現需要飲酒的強迫性體驗，而在停止飲酒后，往往容易出現戒斷綜合征。患者時常會惡心、嘔吐、心中難受，甚至會表現出肢體震顫等軀體疾病，然而這些癥狀在飲酒后則會自行消除，同時會出現幻覺、妄想及相應的情緒和行為異常,易有攻擊或暴力行為,甚至自殺。有報告指出，酒精中毒者的自殺率比一般人群高2～4倍,10%～15%的嗜酒者有自殺行為〔2,3〕。此外，長期不良的飲酒嗜好能夠促進各類軀體及神經系統疾病的發生發展，讓患者難以適應社會,人際關系緊張,更易失業,使經濟更加困難。有關研究表明慢性酒精中毒可導致大腦萎縮〔4，5〕，過量酒精會損傷記憶相關的重要腦區，如海馬區、前額葉皮層等，導致慢性神經炎癥的發生、神經營養物質減少及神經毒性物質釋放，進而導致神經細胞大量凋亡〔6，7〕。而目前的科學研究水平針對這種病尚無良好的藥物來進行治療。近年來，對慢性酒精中毒性引發的大腦神經退行性疾病的病理研究，為慢性酒精中毒后的生物信息學研究及發展打下了堅實的基礎。丁苯酞(NBP)是中國自主研發出的抗缺血性腦卒中藥物。研究證明NBP可通過提高腦血管內皮一氧化氮(NO)和前列環素(PGI)2的水平，抑制谷氨酸釋放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基活性等機制對腦缺血產生治療效果〔8〕。NBP能影響海馬內硫化氫(H2S)及CA1、CA3區5羥色胺(HT)表達量進而改善慢性酒精中毒癥狀〔9〕。動物藥效學研究表明,NBP抗腦缺血效果良好，能夠增加缺血區毛細血管數量，顯著改善腦區的微循環，減輕腦水腫,縮小大鼠局部腦缺血的梗死面積〔10〕。研究表明，NBP可改善線粒體功能和促進腦能量代謝,抑制神經細胞的凋亡，抑制血栓形成等〔11〕。因此推測,NBP可能對慢性酒精中毒導致的神經功能損傷有改善作用,可促進患者功能恢復。本實驗基于NBP干預后慢性酒精中毒大鼠大腦海馬的基因表達數據集，結合了生物信息學的分析方法，篩選出差異表達基因，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)對關鍵mRNA的表達進行驗證。試圖從基因層次探討NBP對慢性酒精中毒的影響及其改善機制。

1 材料與儀器

1.1實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠36只，由鄭州大學動物中心提供。實驗動物隨機分為正常組、模型組和用藥組各12只。喂養4 w后，統一處死，取大腦海馬區組織。正常組喂養蒸餾水，用植物油進行灌胃。模型組喂養6%的酒精溶液4 w，并用植物油進行灌胃，造成慢性酒精中毒；而用藥組也喂養6%的酒精溶液，前2 w用等量的植物油進行灌胃，后 2 w則用等量的植物油稀釋過的NBP 20 mg/kg進行灌胃。

1.2儀器與試劑 主要試劑耗材為Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Solexa測序芯片(flowcell)，主要儀器是Illumina Cluster Station和Illumina HiSeqTM2000系統，均來源于華大基因公司。BNP(批號：118170424)購于石藥集團恩比普藥業有限公司。

Morris水迷宮是由圓形水池、隱藏于水面之下的可移動平臺、圖像自動采集和處理分析系統組成。圓形水池直徑為150 cm,高50 cm，以池壁上的4個等距離點劃分為4個象限(東北，東南，西南，西北)，每個象限池壁圓弧中點為大鼠入水點，平臺放置于SW象限中心，并沒入水面以下2 cm。圖像自動采集和處理分析系統記錄動物游泳軌跡數據用于指標的提取及分析。實驗恒定，水溫控制在25℃，在水池周圍安放藍色不透光布簾保證水池水面光線均一，實驗期間保證環境的安靜。

1.3定位航行實驗 定位航行實驗能夠有效檢測出實驗動物在水迷宮中的學習記憶能力。實驗開始前30 min將大鼠置水迷宮所在房間以適應環境，將大鼠用手托起令其面向池壁，以半隨機方式選擇入水點輕輕放入水中，每天每只訓練 4 次，4個不同象限各1次，實驗進行4 d，每只共計訓練16次。若在60 s內登陸上平臺，則將其搜尋并登上平臺花費的時間作為潛伏期。反之，實驗者則需要將其引導至平臺，同時要將潛伏期記錄為60 s。待登陸平臺后，讓其在平臺上停留30 s。每天實驗后及時統計并計算各組游泳距離、潛伏期和平均游泳速度。

1.4芯片數據處理及差異表達基因(DEGs)的篩選 處死大鼠后，每組6只完整取出大腦海馬組織，并快速放入液氮中保存。提取出海馬中的RNA，使Illumina基因表達的樣品試劑盒和Solexa測序芯片對模型組及用藥組的海馬基因表達進行檢測，并獲取相應的基因表達數據集。借助基因芯片獲取了原始的慢性酒精中毒大鼠海馬基因表達數據集，之后對該數據集進行一系列預處理，并參照Audic〔12〕的數字化基因表達譜差異基因檢測方法，篩選出了最終的差異表達基因的數據。

1.5基因功能顯著性富集分析 基因本體(GO)能夠對差異表達基因進行功能分類，它可從分子功能、細胞組成和生物活動過程等3個層面對目標基因進行詳細的描述。在獲取海馬mRNA的表達譜后，借助GO體系對DEGs進行精準注釋，并進一步做富集化分析，最終得到所有差異基因中明顯富集的所有分類條目，方便對慢性酒精中毒后轉錄組學進行深入的研究。

1.6信號通路顯著性富集分析 京都基因與基因組百科(KEGG)數據庫可以快速查詢到基因所在通路的詳細信息，包括其代謝途徑、所處的細胞信號轉導通路、產物及相互作用的基因等信息，幫助研究者高效地定位具體的研究方向。同時還可以對未知的序列比對(BLAST)序列進行比對，找出具體代謝途徑，迅速定位某段序列所處的通路，其功能很強大，數據覆蓋廣泛。借助KEGG對所有差異表達基因進行信號通路富集分析，將得到的詳細的通路富集信息表讀取到R語言中，加載并運行專業用于科研繪圖的ggplot2包，將信號通路條目作為縱坐標，把各個轉導通路富集的P值作為橫坐標，繪制出一張詳細的信號通信富集氣泡圖。在該氣泡圖中，各個通路代表的氣泡越接近縱坐標軸，即表明其結果可信度越高；氣泡越大則代表信號通路中所包含的差異基因的總數越多；顏色越偏向紅色則顯示該條信號通路的富集程度更高。

1.7蛋白質間相互作用網絡構建 功能蛋白關聯網絡分析(STRING)數據庫囊括了大量的蛋白質功能信息，并且能夠精準比對未知的BLAST序列，給出其詳盡的功能簡介。且該數據庫還可以對不同的蛋白質之間直接或間接功能的相關性進行查詢，支持對目標蛋白質和未知蛋白質之間是否存在相應的作用方式展開預測，可以有效地幫助研究者對獲取的差異基因表達譜及蛋白間互作方式進行綜合研究。借助STRING數據庫研究蛋白質間的相互作用關系，并將相關數據導入到Cytoscape，使用MCODE插件對其子網絡進行聚類分析。

1.8qPCR檢測關鍵基因的表達量 完整取出大鼠的海馬體組織，從兩組中各篩選出3個樣本進行qPCR實驗，用1 ml TRIzol制備勻漿，提取總RNA，測定其純度及濃度，按試劑盒要求進行反轉錄操作，并進行PCR擴增。實時熒光定量PCR體系由20 μl的反應體系組成：SYBR(20×) 0.3 μl，Platinum?Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.2 μl，ddH2O 14 μl，10×PCR緩沖液(-)2 μl，Mg2+(50 mmol/L)1 μl，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μl，正義鏈(10 mol/L) 0.5 μl，反義鏈(10 mol/L)0.5 μl，Template(就是反轉錄產物,也即cDNA)1 μl。反應中的Ct值數據的采集采用校正的閾值設定，實時熒光定量PCR 的方法以β-肌動蛋白(ACTB)作為內參基因，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。 擴增條件為：95℃ 60 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，反應40個循環，引物序列：SEC61g上游：5′-GGACTCGATTCGGCTGGTTA-3′，下游：5′-GCCGATGAACCCCATGATAG-3′；NDUFA4上游：5′-TGCAGGAGCACCTGAGTCAGT-3′，下游：5′-CAAGGAAGGCACCGGATCT-3′；NDUFA2上游：5′-CAACGGTACGTGGAGCTGAA-3′，下游：5′-ACCTCAGCAGCACTCAGATTGT-3′。

2 結 果

2.1模型組與正常組學習記憶功能的對比 第1天，兩組平臺潛伏期無統計學差異(P>0.05)；第2～4天模型組平臺潛伏期顯著延長(P<0.001)，提示模型組學習記憶能力受到損傷。見表1。

表1 正常組與模型組水迷宮平臺潛伏期的 比較

與正常組比較：1)P<0.001

2.2數據預處理及DEGs的篩選 對芯片數據進行相應的處理后，與模型組相比，用藥組共585個DEGs。320個基因表達上調，265個基因表達下調。模型組與用藥組相比有208個DEGs。

2.3差異基因的GO富集分析和通路分析 選取富集程度較高的前10個GO條目進行分析。用藥組與模型組之間對比，GO富集的生物學過程分析表明差異基因主要涉及膜去極化調節,磷酸鹽代謝過程，磷的代謝過程,生物過程調節，生物調節，抗原刺激的炎癥反應,Ⅰ型干擾素產生的調節，Ⅰ型干擾素產生的正調控作用，細胞代謝過程,C4二羧酸轉運等生物學過程，見表2；分子功能表明，DEGs主要涉及催化活性,作用于酯鍵的水解酶活性,磷蛋白磷酸酶的活性,二羧酸的跨膜轉運活性,(醌)活性，磷酸酶的活性,酸性氨基酸跨膜轉運活性,蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，陽離子：糖轉運體活性，水解酶活性等功能，見表3。KEGG富集分析結果見圖1，富集程度最高的前10條信號通路主要與氧化磷酸化通路,黏合連接,蛋白酶體通路,脂肪細胞因子信號通路,絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路,破骨細胞的分化,黏著，幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉導,帕金森病通路,聚酮糖的生物合成等信號通路相關。表4、5是參與細胞信號通路中的DEGs。

表2 差異基因涉及的生物過程

表3 差異基因涉及的分子功能

圖1 信號通路富集

2.4差異基因編碼蛋白的相互作用分析 蛋白質互作網絡圖中的線代表兩個蛋白之間有相互作用關系，而線的數量記作度。對這些差異表達基因進行了進一步的篩選。模型組相比正常組出現差異表達的208個基因，用藥組相比模型組發生差異表達的585個基因，取了一個交集。共獲得了107個DEGs，這107個差異表達基因就是大鼠在慢性酒精中毒以后出現差異表達，而后又經過NBP治療被反向調控的。提示NBP可能通過調控這107個基因對慢性酒精中毒損傷起到了一定的保護作用。

表4 差異基因涉及的信號通路富集分析〔n(%)〕

表5 富集程度最高的前10條通路中所參與的差異基因

隨后在STRING數據庫在線系統上讀取了107個DEGs的基本信息，并運行相應的預測工具，結果顯示僅102個基因能在數據庫中搜到相對應的信息，在得到初步的蛋白互作圖后，將孤立的蛋白除去，并將數據表格導出(見圖2)，再將其導入到Cytoscape軟件中進行可視化操作及中心網絡節點分析，再排除degree為1且分散的局部蛋白互作網絡，才得到最終的中心蛋白互作網絡圖(見圖3)，同時借助MCODE插件分析出最重要的2個子網絡(見圖4)。其中RPSA、RPS9、RPS11、SRP19、sec61G、EIF3E、LARS、Ndufa4、Ndufb6、Ndufa2等是與周圍蛋白相互作用最密集的前10個蛋白，屬于該相互作用網絡的中心蛋白(見表6)，刪除這些中心蛋白后，網絡結構渙散。

圖2 差異基因編碼蛋白質互作網絡

圖3 中心蛋白互作網絡

圖4 最重要的2個子網絡

2.5關鍵mRNA的相對表達量 對Sec61g、Ndufa4、Ndufa2等關鍵基因進行檢測，慢性酒精中毒以后，這3個與內質網及線粒體相關的mRNA表達量顯著降低，提示內質網及線粒體出現了一定的損傷。然而與模型組相比，用藥組海馬體內的Sec61g、Ndufa4、Ndufa2的相對表達量有較為顯著提高(P<0.05或P<0.01)，見表7。提示BNP可能對內質網應激及線粒體損傷的修復作用。使用GraphPad Prism對以上結果進行處理。

表6 PPI網絡中心蛋白

表7 Ndufa2、Ndufa4和Sec61g mRNA的 相對表達量

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

3 討 論

易位通道是新生的肽鏈在共翻譯轉運時所經過的通道。由于N端帶有正電荷，新生的肽鏈無法輕易地進入表面疏水的內質網膜，所以需要借助1個蛋白引導通道才能進入內質網，從而完成蛋白質的轉運，這樣的通道就是易位通道。

Sec61異源三聚體，包含α、β和γ 3個亞基。在真核生物中，Sec61異源三聚體就是易位通道的核心。它的主要作用是能夠形成一個疏水通道，從而幫助新生的肽鏈穿過內質網膜進入內質網。Sec61復合體、內質網膜蛋白與核糖體共同的作用才能形成易位通道。通過Sec61和易位子相關蛋白(TRAP)結合，為分泌蛋白和膜蛋白轉運蛋白的轉運提供便利。然而慢性酒精中毒以后Sec61γ的表達下調可能影響與TRAP組成的復合體的活性導致蛋白質轉運過程中未折疊或錯誤折疊的蛋白質滯留內質網或細胞質中，使得內質網分子伴侶基因表達激活，并引發內質網應激反應(UPR)〔13〕，損傷內質網的正常生理功能。 UPR 主要由3種內質網跨膜受體介導：肌醇需求酶(IRE)1、PKR樣內質網激酶(PERK)和激活轉錄因子(ATF)6。一方面，UPR能夠減少蛋白質的合成從而使內質網應激減輕，在有限程度上降低甚至消除蛋白質的折疊給內質網帶來的負荷。另一方面，由于前者的調節是有限的，隨著蛋白質的過度積累和鈣穩態的進一步失衡，UPR將無法修復細胞損傷并引起細胞凋亡，即由內質網應激引起的細胞凋亡。另外，細胞還可啟動內質網相關蛋白質降解途徑內質網相關蛋白降解(ERAD)從而清除折疊錯誤的蛋白質〔14〕，然而持續的內質網應激可以通過 UPR 激活凋亡信號通路，這可能與阿爾茨海默病等神經退行性疾病的發生機制有關，并且已被實驗證實〔15～18〕。當UPR不足以使細胞對抗應激時，CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)等內質網相關的促凋亡因子表達增加caspase12活化并激活下游caspase3，最終導致凋亡發生。且GO富集顯示，差異表達基因主要與膜磷脂的代謝過程相關，提示內質網可能出現了損傷。在本實驗中，慢性酒精中毒經過BNP治療以后Sec61γ的表達又被反向調控到原始水平，可能在一定程度上修復了易位通道，促使新生肽鏈的轉入和錯誤折疊的蛋白質的轉出，減輕UPR，減少神經細胞的死亡，qPCR實驗進一步驗證了這種結果。

此外，內質網穩態的破壞，會阻礙鈣離子的攝取和轉運，進而影響線粒體的功能〔19，20〕。過度的內質網應激也可能涉及線粒體和細胞色素C的協同作用，從而激活caspase和細胞凋亡。而在本研究中，芯片數據顯示慢性酒精中毒以后Cox6c表達上調，提示線粒體復合體Ⅰ的損傷可能與UPR有關。據Rizzuto等〔21〕的研究，內質網和線粒體之間存在很多密切關系，它們可以通過膜交換鈣離子、脂質和糖化蛋白。內質網1，4，5-三磷酸肌醇(InsP3)/Ca2+通道的開放能影響到線粒體中鈣離子的平衡，也是caspase3作用的靶標之一〔22，23〕。由此可見，慢性酒精中毒會導致內質網和線粒體的損害。

通過KEGG聚類分析顯示，慢性酒精中毒可能與氧化磷酸化通路、阿爾茨海默病信號通路、帕金森病信號通路、亨廷頓病信號通路、D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路相關。提示慢性酒精中毒損害可能是阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病等神經退行性疾病發病的重要因素之一〔24，25〕。慢性酒精中毒可能對海馬的神經元造成損傷，進一步損害其學習記憶能力。通過上調Cox6c和Ndufb8，下調Ndufa2、Ndufa4、Ndufb6等的表達，從而抑制線粒體復合物Ⅰ的功能。不僅使機體產生的游離自由基增加，損傷神經細胞的正常功能，而且還能讓線粒體中的電子傳遞鏈活性被抑制，導致三磷酸腺苷(ATP)產生減少和細胞損傷〔26〕。此外，Cox6c是細胞色素C氧化酶的亞基〔27〕，在本研究中異常上調，也提示著內質網應激可能涉及線粒體及細胞色素C的協同作用而使caspase 激活和細胞凋亡。然而經過BNP治療以后，Ndufa4，Ndufa2又被上調到正常水平，qPCR實驗進一步驗證了這一結果。提示BNP對線粒體具有一定的保護作用，可在一定程度上，對慢性酒精中毒起到治療作用。利用生物信息學的方法能有效地分析基因芯片數據，從而高效地獲取生物內在信息〔28〕，本研究中差異表達基因涉及蛋白酶體通路、氧化磷酸化通路等通路，可能與內質網內積聚的未折疊或錯誤折疊的蛋白的降解及線粒體復合體的修復有關，可能通過這些通路對線粒體及內質網起到一定的保護作用。綜上，通過生物信息學的分析發現BNP可以將由慢性酒精中毒造成差異表達的多個基因反向調控到正常水平，通過調控Sec61G、Ndufa4、Ndufa2等內質網或線粒體相關基因的表達，緩解了內質網應激，減輕線粒體損傷，在一定程度上保護了神經元細胞。BNP對慢性酒精中毒引起的海馬體損傷具有一定的保護作用。