基于DPPH、ABTS法的竹葉花椒抗氧化譜效關系研究

趙容，張萌萌，陳茜，王丹，袁星*

(1.成都中醫藥大學，成都 611137；2.四川省中醫藥科學院，成都 610041)

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)系蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumLinn.)植物，又名藤椒、野花椒、巖椒、蜀椒等[1]，藥食同源，主產于我國東南及西南各省區、陜西秦嶺及甘肅東南部[2]。竹葉花椒果實呈翠綠色，且含油量高達14%～19%，其味芬芳、易揮發，具有清香濃郁、麻味綿長的口感[3]，在食品中作為風味調節劑和防腐劑使用[4]。將竹葉花椒果實經加工可制成藤椒油，餐飲市場上流通的藤椒油有純香型和濃香型兩種味型，以幺麻子品牌為主要代表。藤椒油運用于食品制作可使食物具有藤椒特殊的清香麻風味，即藤椒味，有文獻指出，根據川菜味型命名法則，在理論上應將藤椒味確立為新時代川菜常用基礎味型之一。前期研究表明，竹葉花椒具有清除DPPH、ABTS等自由基的活性，然而其抗氧化的物質基礎尚不明確。本文采用HPLC技術建立竹葉花椒指紋圖譜，測定其抗氧化活性，通過皮爾遜相關分析法及逐步回歸分析法考察指紋圖譜特征峰與抗氧化活性作用的關聯度，旨在為竹葉花椒食品的質量控制及新的應用方向的開發提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：上海華藍化學科技有限公司；2,2＇-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：美侖生物技術有限公司；L-抗壞血酸(Vc)：美國Sigma-Aldrich公司；過硫化鉀、乙醇、甲醇(分析純)：成都市科龍化工試劑廠；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Autoscience AS 5150A超聲波提取器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Bio-Rad iMark酶標儀 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

10批竹葉花椒樣品信息詳情見表1。

表1 10批不同產地竹葉花椒樣品信息Table 1 Information of 10 batches of Zanthoxylum armatum DC. samples from different producing areas

2 HPLC指紋圖譜建立[5]

2.1 色譜條件

Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(C)-0.1%甲酸水(D)梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長328 nm；進樣量10 μL。洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定竹葉花椒粉末(過3號篩)0.5 g，置于20 mL的容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使其溶解，取出，放冷，加甲醇至20 mL定容，搖勻。經0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.3 精密度考察

稱取竹葉花椒粉末(S1)約0.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.4 重復性考察

稱取竹葉花椒粉末(S1)6份，每份約0.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定分析，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明方法的重復性良好。

2.5 穩定性考察

稱取竹葉花椒粉末(S1)約0.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h測定峰面積，以4號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果10個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器穩定性良好，竹葉花椒供試品溶液在8 h穩定。

2.6 指紋圖譜建立

稱取10批竹葉花椒粉末各約0.5 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，記錄各樣品色譜圖，得到10批竹葉花椒樣品的指紋圖譜，將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2004A版)，選取參照圖譜，設定時間寬度，多點校正后進行分析，生成竹葉花椒共有模式對照指紋圖譜。結果得到10批竹葉花椒樣品的指紋圖譜(見圖1)；再以表3中S3為參照圖譜，時間寬度設定為0.10，共標定10個共有峰(見圖2)；各批次樣品色譜圖與對照指紋圖譜相似度結果(見表3)，由表3可知，10批竹葉花椒樣品相似度較好，均大于0.90，表明各產地的花椒質量具有較高的一致性。

圖1 10批竹葉花椒樣品指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlay chart of HPLC fingerprint spectra of 10 batches of Zanthoxylum armatum DC. samples

圖2 竹葉花椒對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint spectra of Zanthoxylum armatum DC.

表3 10批竹葉花椒對照指紋圖譜相似度Table 3 Similarity of HPLC fingerprint spectra of 10 batches of Zanthoxylum armatum DC.

2.7 聚類分析[6]

將10批竹葉花椒黃酮類成分指紋圖譜的10個共有峰的峰面積相對于取樣量量化后作為變量，本研究應用IBM SPSS Statistics 24軟件，利用組間聯接法，以Euclidean Distance為測量度對竹葉花椒樣品進行聚類分析，見圖3。

由圖3可知，當類間距離為10時，10批竹葉花椒樣品被分為3大類，S2、S4、S6～S8、S10聚為一類，S1、S3、S5聚為一類，S9單聚一類；當類間距離為5時，10批竹葉花椒樣品被分為5大類，S2、S4、S6、S8即四川洪雅(兩批)、自貢、三臺聚為一類，S7、S10即四川鹽源聚為一類，S1、S5即四川金陽、鹽源聚為一類，S3、S9各自聚為一類。由此表明，不同產地的竹葉花椒樣品各自聚類呈現產地相關性；四川洪雅、鹽源、金陽雖然各自的竹葉花椒樣品相似度都很高，但也被劃分為不同類，說明同一產地的竹葉花椒既具有相似性也存在差異性。

圖3 10批竹葉花椒樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram for 10 batches of Zanthoxylum armatum DC. samples

2.8 主成分分析

將10批竹葉花椒黃酮類成分指紋圖譜的10個共有峰的峰面積相對于各樣品總峰面積量化后作為變量，利用IBM SPSS Statistics 24軟件對其進行去均值標準化處理后，再進行PCA分析，并以獲取的主成分特征值及貢獻率作為提取主成分的選擇標準。

表4 主成分特征值及貢獻率Table 4 Eigenvalues and contribution rates of principal components

由表4可知，提取的3個主成分特征值均大于1，累積貢獻率為93.899%>85%，說明其可代表竹葉花椒HPLC指紋圖譜中10個共有峰93.899%的信息，故通過提取3個主成分即可對10批竹葉花椒樣品進行綜合評價。

圖4 碎石圖Fig.4 Macadam figure

由圖4可知，提取的3個主成分能夠表征10個共有峰的絕大多數信息。結合載荷圖(見圖5)和旋轉成分矩陣(見表5)分析：F2、F4～F6、F8、F10在主成分1上的載荷絕對值最大，F3、F9主要解釋主成分2的信息，F1、F7在主成分3上的信息貢獻量最大。

圖5 載荷圖Fig.5 Loading plot

表5 因子負荷矩陣Table 5 Factor loading matrix

計算10批竹葉花椒樣品的主成分得分，見表6。

表6 主成分得分、綜合得分排名Table 6 Ranking of principal component scores and comprehensive scores

由表6可知S4、S6、S8質量相似，S1、S9可聚為一類。PCA分析與Q型聚類分析結果具有相似性，同時存在差異性。

3 抗氧化活性測定

3.1 試液制備

3.1.1 供試品溶液制備

取10批竹葉花椒粉末(3號篩)各10 g，加入10倍量甲醇超聲提取3次，每次1 h，合并3次濾液，蒸干。取竹葉花椒甲醇提取物5 mg，加10 mL 95%乙醇制成0.5 mg/mL的母液，再分別制成濃度為0.012，0.018，0.028，0.042，0.072，0.084，0.102 mg/mL的溶液。

3.1.2 Vc溶液制備

精密稱取L-抗壞血酸(Vc)5.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，搖勻，即得Vc原溶液(濃度為0.510 mg/mL)。再分別制成濃度為0.00051，0.001275，0.00255，0.0051，0.006375，0.01275，0.025 mg/mL的Vc樣品液。

3.1.3 DPPH溶液的配制

精密稱取DPPH 4.06 mg，置于100 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，搖勻，即得DPPH溶液(濃度為0.0406 mg/mL)。

3.1.4 ABTS+溶液的配制

參照文獻[7]的方法，將ABTS配制成6.94 mmol/L水溶液， 將K2S2O8配制成2.6 mmol/L水溶液，在使用前將二者混合溶液置于陰涼處12～16 h，使兩者發生完全充分的反應。然后用95%乙醇稀釋原溶液，在波長734 nm處檢測，直到最終測得的吸光度值在0.70±0.02之間，即完成ABTS+溶液的配制。

3.2 DPPH清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應40 min后使用Bio-Rad iMark酶標儀測定吸光度A值，測定波長選擇490 nm。DPPH清除率計算公式如下：

式中：A0表示100 μL DPPH溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值；A1表示100 μL DPPH溶液+100 μL供試品/Vc溶液的吸光度值；A2表示100 μL 95%乙醇+100 μL供試品/Vc溶液的吸光度值。

3.3 ABTS清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應40 min后使用Bio-Rad iMark酶標儀測定吸光度A值，測定波長選擇750 nm。ABTS清除率計算公式如下：

式中：A0表示25 μL 95%乙醇+175 μL ABTS+的吸光度值；A1表示25 μL樣品+175 μL ABTS+的吸光度值；A2表示25 μL樣品+175 μL 95%乙醇的吸光度值。

3.4 EC50值計算

應用SPSS 20軟件進行Probit回歸，預測出EC50值，結果見表7。

表7 DPPH/ABTS法測定的10批竹葉花椒的EC50值Table 7 EC50 of 10 batches of Zanthoxylum armatum DC. determined by DPPH/ABTS methods

由表7可知，竹葉花椒甲醇提取物具有一定的抗氧化能力，但比Vc弱。通過DPPH法測定，10批不同來源的竹葉花椒中，自由基清除能力大小為：Vc>S6>S5>S4>S9>S2>S8>S10>S7>S3>S1。通過ABTS法測定，10批不同來源的竹葉花椒中，自由基清除能力大小為：Vc>S6>S5=S4>S9>S2=S8>S10>S7>S3>S1。可見兩種方法得出的自由基清除能力大小順序一致，S6的抗氧化能力最強，S1的抗氧化能力最弱。

4 竹葉花椒抗氧化活性的譜效研究

4.1 皮爾遜相關分析[8]

應用SPSS 20.0統計學軟件，對10個共有峰面積與10批竹葉花椒提取物的EC50進行雙變量相關分析，有明顯相關作用的特征指紋峰與抗氧化活性的相關系數測定結果見表8。

由表8可知，10個共有峰中5號峰與DPPH自由基清除活性呈極顯著正相關(P≤0.001)，與ABTS自由基清除活性呈極顯著正相關(P≤0.001)；8號峰與DPPH自由基清除活性略呈正相關(P≤0.05)，與ABTS自由基清除活性呈顯著正相關(P≤0.01)；3號峰與DPPH自由基清除活性略呈負相關(P≤0.05)。綜上，5號峰和8號峰與竹葉花椒抗氧化活性呈顯著正相關，3號峰與竹葉花椒抗氧化活性略呈負相關。

表8 特征指紋峰與抗氧化活性的相關系數測定結果Table 8 Determination results of correlation coefficients between characteristic fingerprint peaks and antioxidant activities

4.2 逐步回歸分析[9]

應用SPSS 20.0統計學軟件，以EC50為因變量，共有峰面積為自變量，對10個共有峰面積與10批竹葉花椒甲醇提取物的EC50進行逐步回歸分析，得方差分析表和回歸標準殘差正態P-P圖，見表9和圖6。

表9 方差分析表Table 9 Analysis of variance

注：d表示預測變量：(常量)、峰5、峰2、峰8。

圖6 回歸標準殘差正態P-P圖Fig.6 Regression standard residual normal P-P diagram

由表9和圖6可知，自變量和因變量服從正態分布(P<0.01)，證明特征指紋圖譜峰與其抗氧化活性間存在顯著線性關系，其回歸系數分析表見表10。

表10 回歸系數分析表Table 10 Regression coefficients analysis table

注：a表示因變量：EC50。

第3個模型的R2值最大，為0.933，擬合優度最好，回歸方程為：y=-0.529+1.088×10-8X5-4.934×10-10X2+8.410×10-9X8。

相關分析結果表明：5號峰與竹葉花椒抗氧化活性呈顯著正相關(P≤0.01)，8號峰與竹葉花椒抗氧化活性略呈正相關(P≤0.05)，2號峰與竹葉花椒抗氧化活性呈顯著負相關(P≤0.01)。

5 討論

目前，藤椒種植業發展迅猛，以川渝地區為例，已逐漸形成了以四川洪雅、峨眉山、三臺、金陽、平昌等為代表的全國聞名的藤椒基地，其中，洪雅被譽為“中國藤椒之鄉”[10]。隨著菜系和餐飲產業的發展，藤椒的清香麻風味近年來越來越受歡迎，其藤椒味作為獨立的風味廣泛使用，藤椒雞、藤椒魚等藤椒風味菜品深受食客喜愛。本研究通過建立竹葉花椒HPLC指紋圖譜，可有效控制其食品質量，進一步為品質評價提供科學依據。以文中考察的方法建立了10批不同產地竹葉花椒黃酮類成分的HPLC指紋圖譜，通過共有模式確定了10個共有峰，結合相似度評價和Q型聚類分析以及PCA分析可知，10批竹葉花椒的相似度大于0.90，共有峰相對保留時間符合程度較好，并且質量與產地具有一定相關性，但同一產地的竹葉花椒不完全聚在一起，說明同一產地的竹葉花椒既具有相似性也存在差異性。

本研究通過DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法對不同批次竹葉花椒的抗氧化活性進行分析，結果表明10批竹葉花椒均表現出明顯的抗氧化活性，其中以四川自貢的竹葉花椒自由基清除能力最佳。藤椒在食品中也常作防腐劑使用，其抗氧化活性物質與防腐作用相關，表明竹葉花椒具備天然抗氧化劑的開發價值。結合竹葉花椒指紋圖譜進行譜效關系研究，經皮爾遜相關分析與逐步回歸分析，可以發現，5號峰、8號峰與竹葉花椒抗氧化活性呈正相關，2號峰、3號峰與竹葉花椒抗氧化活性呈負相關。后期可鑒定得到相關的活性化合物，考慮從單體層面提取天然防腐劑用于食品加工。此外，竹葉花椒抗氧化活性物質可應用于保健品、日化產品方面，拓寬竹葉花椒的應用方向和市場。