多酚氧化酶的固定化及其酶學性質研究

劉苑皓，趙興秀，舒梨，何義國

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一種化學性質穩定并廣泛存在于植物、菌類、昆蟲及哺乳動物體內的氧化還原酶[1]。在有氧條件下，單酚類化合物羥基化反應生成兒茶酚，兒茶酚脫氫反應后與O2結合形成醌并自發發生非酶反應在水中聚合，最終形成水不溶性聚合物而被除去[2]。游離酶在水溶液中有穩定性差、易流失、不可回收等缺點，導致處理成本過高，限制了其實際應用[3]。同時，100余種真菌產多酚氧化酶統計結果表明，絕大部分酶作用的最適pH在3.0～5.0之間[4]，而工業染料廢水一般呈現高溫、高pH和高鹽等特點[5]。酶在此條件下容易因劇烈的外部環境導致活性部位結構失活變性，無法起到催化作用。固定化酶(immobilized enzyme)是指利用物理或者化學手段固定在載體上或者束縛在一定區域內保持催化活性并能連續反應和反復使用的酶制劑[6]。固定化酶的優點主要是熱穩定性好，在堿性條件下具有較好的穩定性和貯存穩定性且能夠實現多次重復利用等[7]。

在實際應用中，Yagüe 等研究了PPO降解高單寧含量的啤酒工業廢水的能力，熱解氣相質譜分析顯示多酚熱解產物(主要是苯酚和鄰甲基苯酚)都有所降低[8]。但未經過固定化的酶存在穩定性差、易流失、不能重復利用等缺點，導致處理成本過高。油橄欖壓榨廢水(OMW)是生產橄欖油工業中特有的副產物，Alessandro采用固定化PPO處理OMW，可以脫除多酚聚合物，如兒茶酚和二羥基苯乙烯酸的脫除率分別達到了95%和 99%，還能促進 OMW流體的部分脫色及降低污水毒性[9]。同時固定化提高了酶的穩定性，使酶多次重復利用，降低了處理成本[10]。

以海藻酸鈉包埋法(polyphenol oxidase immobilized by sodium alginate,A-PPO)和戊二醛交聯法(polyphenol oxidase immobilized by glutaraldehyde crosslinking, C-PPO)兩種固定化方法制備固定化多酚氧化酶。海藻酸鈉包埋法中將戊二醛的使用次序提前到酶液與海藻酸鈉混合振蕩過程中，使多酚氧化酶與戊二醛之間能夠形成化學鍵穩定結合，以期能有更好的固定化效果。戊二醛交聯法中，采用成本低廉的戊二醛作為交聯劑，使戊二醛與酶和載體之間都能夠形成穩定的化學鍵來提高固定化效果。試驗考察了固定化酶的最佳制備條件及其酶學性質，比較了固定化方法對固定化酶性質的影響，為利用固定化酶處理食品工業廢水提供了一定的理論數據參考。

1 材料與儀器

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、海藻酸鈉(sodium alginate，SA)、殼聚糖(chitosan，CTS )：購于Bomei(USA)公司；鈉基蒙脫土(montmorillonite，MMT)： 購于浙江三鼎科技有限公司；戊二醛(50%)：分析純，購于南京化學試劑股份有限公司；其他試劑：均為分析純。

TG-16型醫用離心機 四川蜀科儀器有限公司；201-3AB型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6B型數顯恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；SHZ-A型水浴恒溫振蕩器 上海賀德實驗設備廠；V-1000型可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司。

2 試驗方法

2.1 游離酶酶活測定

將多酚氧化酶母液(1 mg/mL)稀釋至10 mg/L，取1 mL 10 mg/L多酚氧化酶液加入到12 mL鄰苯二酚溶液(10 mmol/L)中，在25 ℃條件下反應5 min，在410 nm波長下測定其吸光度，以1 mL pH 6.8磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)作空白對照。在410 nm吸光度下每毫升樣品每分鐘變化0.001為一個酶活單位U[11]。固定酶活以每組最高吸光度為100%酶活，其余值與最高值的百分比為相對酶活。

2.2 海藻酸鈉包埋法

將一定量海藻酸鈉與pH 6.8 PBS混合，60 ℃加熱溶化，冷卻至室溫后備用；將10 mg/L多酚氧化酶液與海藻酸鈉按照體積比1∶1混合振蕩，添加少量戊二醛(體積分數4%)，常溫振蕩40 min。用注射器吸取上述混合液，勻速滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈉凝膠珠；更換氯化鈣溶液，將凝膠珠置于氯化鈣溶液中4 ℃環境下硬化2 h，濾出凝膠珠，蒸餾水洗滌數次，4 ℃貯存備用[12]。

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響

設置海藻酸鈉的濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，CaCl2溶液濃度為2%(V/V)，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.1.2 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響

設置CaCl2的濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，海藻酸鈉溶液濃度為2%，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.1.3 硬化固定時間對A-PPO酶活力的影響

設置固定化時間分別為1，2，3，4 h。海藻酸鈉溶液濃度為2%，CaCl2溶液濃度為2%，制備A-PPO，測定酶活。

2.2.2 正交試驗

根據2.2.1單因素試驗結果，得到正交試驗因素水平，見表1。

表1 A-PPO正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels of A-PPO

按照正交表設計標準制定L9(33)正交試驗方案，參考其結果進一步完善A-PPO的制備方案。

2.3 戊二醛交聯法

2.3.1 蒙脫土/殼聚糖插層復合物的制備

稱取3.3 g殼聚糖置于250 mL乙酸溶液(體積分數1%)中，室溫攪拌，緩慢加入NaOH溶液(質量分數20%)，用pH計檢測調節pH到4.9。稱取4.0 g蒙脫土于100 mL蒸餾水中攪拌溶脹2 h，再將其在恒溫水浴鍋中預熱至60 ℃，待預熱完成后將殼聚糖緩慢滴入蒙脫土懸液中攪拌，靜置6 h，5000 r/min離心8 min，傾倒廢液后將產物用蒸餾水洗滌至上清液呈中性并于60 ℃烘干，在研缽中將殼聚糖/蒙脫土插層復合材料研磨至200目，在干燥皿中保存備用[13]。

2.3.2 戊二醛交聯多酚氧化酶

將0.02 g CTS/MMT插層復合物加入到10 mL 1.0%戊二醛溶液中，30 ℃振蕩交聯2 h，交聯完成后用蒸餾水洗滌抽濾，用PBS(0.05 mol/L，pH 7.0)反復洗滌至上清液中無戊二醛殘留，再次抽濾，于60 ℃干燥后備用。取2 mL多酚氧化酶酶液(0.1 mg/mL，pH 4.0)加入CTS/MMT插層復合物中，室溫下振蕩固定6.5 h。固定化完成后以8000 r/min離心10 min，抽濾，用PBS(0.05 mol/L，pH 7.0)反復洗滌，離心抽濾，直至上清液中檢測不到PPO，常溫干燥過夜，制成C-PPO[14]。

2.3.3 殼聚糖/蒙脫土插層復合物表征分析

制備得到的殼聚糖/蒙脫土插層復合物需要進行表征分析，用以確定插層的效果以及確定其能否作為固定化酶的載體使用。

2.3.3.1 X-射線衍射(X-RD)分析

X射線衍射(X-RD)圖譜采用Cukα輻射源，管電壓40 kV，管電流500 mA，掃描范圍3°～40°[15]。

2.3.3.2 紅外光譜法

紅外光譜法采用Nicolet-iNIO+iZIO FTIR顯微紅外光譜儀記錄，KBr壓片法，掃描范圍4000～500 cm-l。

2.3.4 單因素優化

2.3.4.1 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響

取5份CTS/MMT插層復合物各0.0133 g，將CTS/MMT插層復合物與濃度分別為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的戊二醛溶液混合，30 ℃振蕩交聯2 h，余下操作同2.3.2。分別取5份 1 mL 0.1 mg/mL PPO酶液(pH 4.0)加入CTS/MMT插層復合物，常溫振蕩固定6 h制備不同戊二醛濃度的C-PPO。

2.3.4.2 振蕩固定pH對C-PPO酶活力的影響

取5份pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 (0.1 mg/mL)PPO酶液到5份質量為0.0133 g攪拌交聯干燥的CTS/MMT插層復合物中(操作同2.3.2)，制成不同振蕩固定pH的C-PPO。

2.3.4.3 酶與載體質量比對C-PPO酶活力的影響

取5份1 mL(0.1 mg/mL)PPO酶液(pH 4.0)加入5份質量分別為0.0154，0.0143，0.0133，0.0125，0.0118 g 攪拌交聯干燥的CTS/MMT插層復合物中(操作同2.3.2)，制成不同酶與載體質量比的C-PPO。

2.3.4.4 固定化反應時間對C-PPO酶活力的影響

取5份1 mL(0.1 mg/mL)PPO酶液(pH 4.0)加入到攪拌交聯干燥的C-PPO中，常溫振蕩固定時間分別為3，4，5，6，7 h，制備不同固定化時間的C-PPO。

2.3.5 正交試驗

根據2.3.4單因素試驗結果，得到正交試驗因素水平，見表2。

表2 C-PPO正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factors and levels of C-PPO

按照正交表設計標準制定L9(33)正交試驗方案，參考其結果進一步完善C-PPO的制備方案。

2.4 游離及固定化酶酶學性質探究

酶學性質的探究是關于游離多酚氧化酶和兩種不同方法固定化多酚氧化酶關于pH穩定性、熱穩定性、貯藏穩定性和固定化酶重復使用率的探究，以及總蛋白含量和米氏常數的測定[16]，在測定游離酶及固定化酶酶活力過程中所涉及的反應溫度、pH參考文獻[17,18]。

2.4.1 游離及固定化酶的單因素優化

2.4.1.1 pH穩定性

分別取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份分別置于pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的緩沖溶液中2 h，固定化酶用pH 6.8的PBS洗滌至中性，抽濾常溫干燥，測定酶活。

2.4.1.2 熱穩定性

取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份分別置于20，30，40，50 ℃ 4個環境溫度下2 h，冷卻至室溫，測定酶活。

2.4.1.3 貯藏穩定性

將同批次制備的C-PPO固體0.005 g、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份于4 ℃避光保存，分別在0，5，10，15，20，25 d測定酶活。

2.4.1.4 重復使用率測定

取0.005 g C-PPO固體、A-PPO 1 mL測定酶活，測定后用pH 6.8 的PBS洗滌抽濾，再次測定，反復操作，至測得相對酶活低于50%停止。

2.4.2 固定化率測定

配制考馬斯亮藍溶液及1 mg/mL牛血清蛋白，制作標準曲線[19]。分別取C-PPO固體0.005 g、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL測定A595 nm處的吸光度值，參照標準曲線方程計算各樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。

2.4.3 米氏常數測定

配制濃度為5，10，15，20，25 mmol/L的鄰苯二酚溶液，取0.005 g C-PPO固體、游離PPO 1 mL(0.1 mg/mL)、A-PPO 1 mL各5份，參照2.3.2、2.2、2.1中測定酶活操作添加試劑，每分鐘測定一次吸光度，每組測定5次，對5次測定值作散點圖，以趨勢線斜率為反應速度，分別以[1/V]為橫坐標、[1/S]為縱坐標作圖，得到Lineweaver-Burk方程，直線橫截距為-1/Km，縱截距為1/Vmax[20]。

2.5 數據處理

試驗操作重復3次，每個樣品設3個平行，采用Origin 8.5軟件進行數據分析。

3 結果與分析

3.1 海藻酸鈉包埋法結果

3.1.1 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響

圖1 CaCl2濃度對A-PPO酶活力的影響Fig.1 Effect of CaCl2 concentration on A-PPO enzymatic activity

由圖1可知，在制備過程中發現，當CaCl2濃度為1.5%時，制備的凝膠珠成型效果較差，導致測定酶活時易破裂。在CaCl2濃度達到3%時，凝膠珠外部的CaCl2易溶解在水相中，A-PPO在CaCl2濃度為1.5%和3%時相對酶活數值較高，實質上是因為CaCl2釋放溶解在水相中，導致測定值偏高，不具有參考性。只有當CaCl2濃度為2.5%左右時，形成的凝膠珠形狀固定保存時間較長，相對酶活較高。

3.1.2 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響

圖2 海藻酸鈉濃度對A-PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on A-PPO enzymatic activity

由圖 2可知，在制備過程中發現，當海藻酸鈉濃度大于2.5%時，凝膠珠粘度過大，導致凝膠珠成型緩慢且形狀不規則。而當海藻酸鈉濃度在1.5%左右時，雖然凝膠珠成型較快且形狀規則，但是交聯后的成珠效果不好，多數凝膠珠有破裂現象，這是因為海藻酸鈉濃度過低，導致凝膠珠粘度低，物理強度小，無法有效形成穩定的結構。海藻酸鈉濃度在2.0%時，A-PPO的相對酶活較高且凝膠珠成型速度適中、形狀規則、結構穩定，能夠有效包埋多酚氧化酶。

3.1.3 固定化時間對A-PPO酶活力的影響

圖3 固定化時間對A-PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization time on A-PPO enzymatic activity

由圖 3可知，固定化3 h的A-PPO相對酶活比固定化2 h的降低30%。低溫環境有利于CaCl2硬化，但是固定化時間越長，凝膠珠硬化效果越好，可能會導致固定化酶的空間位阻越大，酶與底物的接觸減少，酶活降低，另一個原因可能是固定化時間過長導致酶的部分結構改變，活性降低。因此，選擇固定化2 h繼續后續試驗。

3.1.4 正交分析

表3 海藻酸鈉包埋法正交試驗結果表Table 3 The results of orthogonal experiment for sodium alginate embedding method

續 表

由表 3可知，最佳試驗組合為試驗號6，因素條件為2.0% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時間2 h。參照方差分析中的極差順序排列可知各單因素對A-PPO酶活力大小影響的順序為CaCl2濃度>固定化時間>海藻酸鈉濃度，各單因素的最優值分別為2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時間2 h。最終確定最優組合為2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉和固定化時間2 h。

3.2 戊二醛交聯法

3.2.1 殼聚糖/蒙脫土插層復合物表征分析

圖4 CTS/MMT(a)、蒙脫土(MMT)(b)、 殼聚糖(CTS)(c)X-RD圖譜Fig.4 X-RD chromatograms of CTS/MMT(a), montmorillonite (MMT)(b) and chitosan(CTS)(c)

由圖4可知，殼聚糖/蒙脫土復合插層物在2θ=5.62°出現特征衍射峰，蒙脫土在2θ=5.66°出現特征峰值，由Bragg方程(2dsinq=l，d表示硅酸鹽片層間的平均距離，l表示入射X射線的波長，l=0.15416 nm)得出殼聚糖/蒙脫土復合插層物和蒙脫土的層間距分別為1.57 nm和1.55 nm，蒙脫土層間距增加，說明形成了插層結構。

圖5 CTS/MMT(b)、蒙脫土(MMT)(a)、 殼聚糖(CTS)(c)紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of CTS/MMT(b)，montrnorillonite (MMT)(a)and chitosan(CTS)(c)

由圖 5可知，蒙脫土在3619 cm-1處出現O-H的伸縮振動吸收峰，在3429 cm-1處出現吸收峰是由于層內和層內氫鍵的伸縮振動；在1637 cm-1處出現H-O-H的伸縮振動吸收峰；在1034 cm-1處出現Si-O伸縮振動吸收峰；在916 cm-1和623 cm-1處吸收峰為Al-OH的伸縮振動。在殼聚糖圖譜中，由于O-H和N-H伸縮帶的重疊在3436 cm-1處出現吸收峰。在2921 cm-1處的吸收峰為非芳香族的C-H的伸縮振動，在1605 cm-1吸收峰為N-H的彎曲，在1383 cm-1吸收峰為C-H的彎曲，在1151 cm-1和1087 cm-1為C-O的伸縮振動。在蒙脫土/殼聚糖插層復合物紅外光譜中保留了部分殼聚糖和蒙脫土的伸縮振動吸收峰，在3622 cm-1和3430 cm-1處存在O-H的伸縮振動吸收峰，在2922 cm-1處吸收峰為鏈狀烴基C-H變形振動，同時，由于殼聚糖的N-H彎曲振動與蒙脫土的H-O-H伸縮振動是殼聚糖/蒙脫土插層復合物波峰向低峰處移動，在1517 cm-1處出現吸收峰，結果表明殼聚糖與蒙脫土片層間發生了插層，形成了插層復合物。因此，該殼聚糖/蒙脫土插層復合物可以用于多酚氧化酶的固定。

3.2.2 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響

圖6 戊二醛濃度對C-PPO酶活力的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde concentration on C-PPO enzymatic activity

由圖 6可知，在戊二醛濃度低于1.25%時，C-PPO的相對酶活隨著戊二醛濃度的增大而上升；在戊二醛濃度達到1.25%時，相對酶活達到最大；在戊二醛濃度大于1.25%之后，C-PPO酶活力開始下降，這是因為戊二醛本身醛基具有較大的范德華力，與殼聚糖形成共價鍵的游離醛基可與酶上的-OH、-NH3等基團共價結合形成共價鍵，導致酶蛋白所含有的有效基團被占用無法與底物有效結合，催化底物的氧化變化，導致C-PPO的酶活力降低。當戊二醛濃度在1.00%～1.50%時，C-PPO的相對酶活相差較小，因此設計正交試驗時將戊二醛濃度因素設置3個水平梯度1.00%、1.25%、1.50%。

3.2.3 pH值對C-PPO酶活力的影響

圖7 固定化pH對C-PPO酶活力的影響Fig.7 Effect of immobilization pH on C-PPO enzymatic activity

由圖 7可知，在多酚氧化酶固定化過程中，C-PPO的酶活力受到固定化pH的影響較大。在固定化pH低于4.0時C-PPO的相對酶活僅為14%左右，這是因為過酸環境中大量的H+與酶和CTS/MMT插層復合物中的-OH結合，占用載體中的基團，同時，過酸環境對酶本身的結構和CTS/MMT插層復合物內部結構及其與戊二醛的交聯共價鍵造成破壞，降低了酶的催化能力和CTS/MMT插層復合物對酶蛋白的固定能力。在固定化pH大于4.0之后，C-PPO的相對酶活一直呈現下降趨勢，這是由于多酚氧化酶本身適用于偏酸環境反應，隨著pH增大，固定化環境中的OH-增多，破壞酶蛋白本身的結構并且作為抑制劑使酶出現鈍化現象。由于pH對酶蛋白的結構和活性影響較大，且對CTS/MMT插層復合物的結構有影響，因此在設計正交試驗時應使pH值之間的梯度盡可能小，因此設計固定化pH值為3.5，4.0，4.5。

3.2.4 酶與載體質量比對C-PPO酶活力的影響

圖8 酶與載體質量比對C-PPO酶活力的影響Fig.8 Effect of the mass ratio of enzyme to carrier on C-PPO enzymatic activity

由圖8可知，C-PPO的酶活力受酶與載體質量比的影響不是很大，在酶與載體質量比低于80(mg/g)，C-PPO的相對酶活隨著酶與載體質量比的增大而緩慢上升，這是因為多酚氧化酶的量尚未達到CTS/MMT插層復合物對酶蛋白固定的飽和值，因此隨著酶量的增大，C-PPO的相對酶活梯次上升。當酶與載體質量比大于80 (mg/g)之后，C-PPO的相對酶活反而呈現下降趨勢，這是因為質量一定的CTS/MMT插層復合物上酶的結合固定位點的數目一定，當酶與載體質量比大于80 (mg/g)之后，這些結合位點出現過飽和現象，同一個載體位點因為有過多的酶蛋白存在而減少了酶與底物接觸的表面積，酶的催化作用受到抑制，因而出現了酶量增加相對酶活反而降低的現象。由于測定酶與載體質量比對C-PPO酶活力的影響試驗中各組相對酶活始終保持在90%以上，其對C-PPO酶活力的影響較小，因此設計正交試驗方案時設定酶與載體質量比的3個水平為75，80，85(mg/g)。

3.2.5 固定化反應時間對C-PPO酶活力的影響

圖9 固定化反應時間對C-PPO酶活力的影響Fig.9 Effect of immobilization time on C-PPO enzymatic activity

由圖9可知，在固定化反應時間小于6.0 h時，C-PPO的酶活力隨著固定化反應時間的增大而逐漸上升，這是因為固定化反應過程中的交聯鍵固定反應尚未完成，隨著固定化反應間的增大，酶的固定量逐漸上升并趨于飽和，使C-PPO的相對酶活逐漸上升。當固定化反應時間大于6.0 h之后，C-PPO的相對酶活開始略有下降，這可能是因為固定化反應時間過長，持續的振蕩使部分固定不牢的酶蛋白掉落，C-PPO的酶含量低于飽和酶量。固定化反應時間在6.0～7.0 h時，C-PPO的相對酶活始終保持在90%以上，可見固定化反應時間在6.0～7.0 h時對C-PPO酶活力的影響基本一致，因此設計正交試驗時固定化反應時間的3個水平分別設為6.0，6.5，7.0 h。

3.2.6 正交試驗分析

表4 戊二醛交聯法正交試驗結果表Table 4 The results of orthogonal experiment for glutaraldehyde crosslinking method

由表 4可知，最優水平組合為試驗號6，其因素組合為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質量比75(mg/g)、固定化反應時間6.5 h。參照方差分析中極差順序可知，4個單因素對C-PPO酶活力影響的主次順序依次為振蕩固定pH>振蕩固定時間>戊二醛濃度>酶與載體質量比。各單因素的最優值分別為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質量比80 (mg/g)、固定化反應時間6.5 h。依次參考直觀分析和因素指標，確定四因素三水平正交試驗最優組合為1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質量比75(mg/g)、固定化反應時間6.5 h。

3.3 酶學性質的探究

3.3.1 pH穩定性

圖10 游離及固定化酶pH穩定性探究Fig.10 Study on pH stability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖10可知，游離酶與兩種固定化酶的pH穩定性差距較大，游離酶在環境pH為5.0～7.0之間始終保持90%以上的相對酶活，說明多酚氧化酶本身的結構性質都比較穩定，且最適的保存環境應是中性及弱酸性環境，這也解釋了自然界中多酚氧化酶的來源遍及各種植物、哺乳動物、昆蟲和真菌。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO僅在環境pH為6.0～8.0時能夠保持60%以上的相對酶活，與游離酶相比，其pH穩定性反而降低。海藻酸鈉中含有大量的-COO-結構，酸性條件下轉化為-COOH，抑制酶蛋白的活性，由此可見海藻酸鈉包埋法制備固定化酶對酶的pH穩定性有抑制作用。戊二醛交聯法制備的C-PPO在環境pH為4.0～8.0時均可保持50%以上的相對酶活，可見C-PPO的pH穩定性相比游離酶已經大幅提高，這是因為戊二醛中的醛基對H+和OH-有一定的中和能力，同時也因為CTS/MMT插層復合物與酶蛋白的結合減少了外界離子的進入，維持了微環境pH的相對穩定。

3.3.2 熱穩定性

圖11 游離酶及固定化酶熱穩定性探究Fig.11 Study on thermostability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖 11可知，將游離及固定化酶分別在15～40 ℃的6個梯度溫度下保存2 h，測定酶活。游離酶僅在25～35 ℃時可以保持較高活性，當溫度低于25 ℃或者高于35 ℃時酶活性大幅下降，這是由于低溫抑制其基團活性，而高溫則破壞蛋白質結構，使酶失活。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO在15～40 ℃均保持40%以上的相對酶活，可見固定化酶由于酶與載體之間的結合能夠有效提高其熱穩定性，有利于酶在較高溫度的環境下依舊保持其酶活力。戊二醛交聯法制備的C-PPO在15～40 ℃均能保持80%以上的相對酶活，可見此法固定多酚氧化酶對酶的熱穩定性提高作用遠大于海藻酸鈉包埋法。海藻酸鈉制備的凝膠珠中水是熱的良導體，無法將內部環境與外界熱源隔離開，而C-PPO由于酶的基團與CTS/MMT插層復合物之間的共價結合，有效提高了酶對環境溫度變化的適應能力，提高了其熱穩定性。

3.3.3 貯存穩定性

圖12 游離酶及固定化酶貯存穩定性探究Fig.12 Study on storage stability of free enzyme and immobilized enzymes

由圖 12可知，游離酶與C-PPO的貯存穩定性基本一致，在-4 ℃保存15 d時依舊能夠保持40%以上的相對酶活。A-PPO約在12 d時能夠保持40%以上的酶活力，在15 d之后反而出現上升趨勢，實際上是因為海藻酸鈉凝膠珠外面的CaCl2溶解，導致在A410 nm處測定吸光度時由于鄰苯二酚溶液渾濁測定值較真實值偏大。綜合來看，A-PPO在0～12 d時間內的貯藏穩定性優于游離酶和C-PPO，但是在12 d之后因為CaCl2溶解凝膠珠破裂釋放多酚氧化酶等原因使其貯藏穩定性快速下降，導致相對酶活迅速降低，這表明短期貯存12 d海藻酸鈉包埋法固定酶的貯存穩定性更好，時間延長則戊二醛交聯法固定酶的貯存穩定性更好?？偟膩碇v，固定化酶本身已經消耗大部分酶活力，短期貯存導致其相對酶活的持續降低將會大大增加在工業領域投入應用的難度。

3.3.4 重復使用次數測定

圖13 固定化酶重復使用次數的測定Fig.13 Determination of reuse times of immobilized enzymes

由圖13可知，固定化酶確實可以多次使用，但是不同固定化方法導致其使用次數不盡相同。海藻酸鈉包埋法制備的A-PPO在第2次使用時其相對酶活已降低到50%以下，可見其重復利用的效率并不高，主要是因為海藻酸鈉形成的凝膠珠并不具備較高的物理強度，使用1次之后便會破裂，導致內部固定的酶流失。由此可見，海藻酸鈉包埋法由于載體本身的物理強度過低，不適合作為固定化酶的主要材料。

戊二醛交聯法制備的C-PPO在第4次使用時依舊保持50%以上的相對酶活，可見其固定化效果較好，重復使用率也相對較高，這得益于CTS/MMT插層復合物本身的物理強度較高，戊二醛的交聯作用有效固定酶蛋白，使C-PPO能夠達到固定化以提高其使用次數。

3.3.5 固定化率測定

以標準牛血清蛋白濃度為橫坐標，相應吸光值為縱坐標，測得考馬斯亮藍G250標準曲線回歸方程y=8.6429x+0.0649(R2=0.9901)。通過回歸方程計算游離酶及固定化酶的總蛋白含量，見表5。

表5 游離及固定化酶總蛋白量Table 5 Total protein content of free and immobilized enzymes

A-PPO比活力為游離酶的一半左右，這是由于被包埋法固定住的酶與底物的接觸面積減少，戊二醛與酶的部分基團之間形成化學鍵，降低了酶活性。C-PPO比活力為游離酶的43%，一方面是由于多酚氧化酶被固定于插層物的微小空間中，與底物的接觸面積減??；另一方面是因為戊二醛占用了部分活性基團。A-PPO與C-PPO的總酶活都僅有游離酶的1/10左右，一方面是因為固定化酶量少于游離酶；另一方面是由于上述兩種原因對酶活性的限制。

海藻酸鈉包埋法的酶活回收率為18.6%，戊二醛交聯法的酶活回收率為24.0%，可見戊二醛交聯固定酶的能力較好。海藻酸鈉包埋法是通過海藻酸鈉形成凝膠珠時將液相中的多酚氧化酶固定，其固定酶量取決于酶溶液的濃度，而戊二醛交聯法是通過戊二醛分別與酶和載體之間形成的化學鍵將多酚氧化酶固定在殼聚糖與蒙脫土插層形成的微小空間內，此法固定酶量取決于殼聚糖與蒙脫土的插層效果。測定固定化酶量在制備A-PPO和C-PPO時酶液的濃度和用量都保持一致，可見通過形成化學鍵能夠更好地固定酶。

3.3.6 米氏常數測定

圖14 游離及固定化酶Lineweaver-burk圖Fig.14 Lineweaver-burk figure of free and immobilized enzymes

由圖 14可知，以游離及固定化酶米氏常數測定所作Lineweaver-burk圖中的公式計算截距，再由截距計算Vmax和Km值，得到表 6。

表6 試驗結果表Table 6 The result of experiment

游離PPO的Km值小于兩種固定化酶，說明固定化酶與底物的親和力均小于游離酶。這是因為多酚氧化酶固定化后，酶分子的空間結構受到限制，活性部位無法完全與底物接觸。同時，載體的空間結構造成的空間障礙和底物的擴散限制也使酶與底物的親和力降低。比較兩種不同方法的固定化酶可知，A-PPO的Km與C-PPO相近，表明兩種固定酶與底物親和力相近。游離PPO的Vmax值遠大于固定化酶，酶的固定化使其鄰域的底物濃度與游離酶也明顯不同，且固定化酶催化反應體系中擴散限制的存在，使得固定化酶的Vmax值均低于游離酶。同時，C-PPO的Vmax值高于A-PPO，表明包埋法固定多酚氧化酶載體上酶分子的自由度小于C-PPO，催化速率相對較低。

4 結論

采用海藻酸鈉包埋和戊二醛交聯兩種方法固定多酚氧化酶，確定其最優固定化條件，分別為海藻酸鈉包埋法：2.5% CaCl2、2.5%海藻酸鈉、固定化時間2 h；戊二醛交聯法：1.25%戊二醛、振蕩固定pH 4.5、酶與載體質量比75 (mg/g)、固定化反應時間6.5 h。同時對游離多酚氧化酶和固定化多酚氧化酶的酶學性質進行了研究。結果表明：游離酶、A-PPO和C-PPO的比活力分別為864，490，371 U/mg，A-PPO和C-PPO的酶活回收率分別為18.6%和24.0%。同時，固定化酶在pH穩定性、熱穩定性上優于游離酶，戊二醛交聯法固定酶的效果優于海藻酸鈉包埋法。戊二醛交聯法固定化酶的能力更強，但是比酶活要犧牲50%左右。海藻酸鈉包埋法中凝膠珠的結構大大限制了酶與底物的接觸，同時由于凝膠珠本身的物理強度過低，限制了其重復利用的可能?？梢?，海藻酸鈉并不是酶固定化的良好載體。戊二醛作為交聯劑可以通過形成化學鍵來達到固定酶的目的，卻需要占用一定數量的活性基團，對酶活力有一定的限制。就試驗的兩種固定化酶方法，戊二醛是固定化酶過程中較好的交聯劑。食品及調味品行業的種類繁多，生產工藝及所用原材料各不相同，因此食品工業廢水成分復雜，差異性較大，導致酶的需求量較大，處理成本較高。酶的固定化使酶的穩定性增加，對環境耐受性增強，可回收重復利用，大大降低了工業廢水處理的成本。