7株米曲霉與滬釀3.042發酵制備郫縣豆瓣用甜瓣子的對比研究

李潔芝，鄧維琴，張其圣,3，楊國華，陳功,3，范智義， 陳相杰，周志帥，李恒

(1.四川省食品發酵工業研究設計院，成都 611130；2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司， 成都 611732；3.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620030； 4.成都市丹丹川菜調味品產業研究院有限公司，成都 611730)

郫縣豆瓣擁有300多年的制作歷史，其醬香濃郁醇厚、色澤紅潤油亮、瓣粒酥脆、辣而不燥，被譽為“川菜之魂”[1]。按照GB/T 20560-2006《地理標志產品 郫縣豆瓣》的要求[2]，蠶豆接種米曲霉后，經制曲工藝制成甜瓣子，再將甜瓣子與辣椒醅混合發酵，得到郫縣豆瓣產品。由此可見，由米曲霉主導的甜瓣子發酵是郫縣豆瓣生產的關鍵工序，米曲霉的發酵性能在很大程度上決定了郫縣豆瓣產品的質量品質、生產成本和市場競爭力。目前，制曲菌種主要是滬釀3.042米曲霉，但單一使用該菌株發酵存在產生酶系不全等問題[3]，現階段國內關于米曲霉發酵郫縣豆瓣的研究多集中于高酶活力米曲霉的選育鑒定、酶學特性及混菌制曲等方面[4,5]，對米曲霉發酵甜瓣子的理化指標、感官指標的研究報道較少。本文對比研究了7株高產蛋白酶、α-淀粉酶的米曲霉試驗菌株與滬釀3.042米曲霉制備甜瓣子的發酵性能差異，以期得到產酶能力強、理化指標及感官指標優良的具有生產應用潛能的郫縣豆瓣釀造專用米曲霉菌株。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

干蠶豆瓣、面粉、麩皮、食用鹽、黃豆粉等：均為市售。

實驗菌株：由本實驗室分離篩選的高產蛋白酶、α-淀粉酶米曲霉菌株(采用黃豆汁固體培養基保藏)，菌株編號分別為24M-1、21M-2、BM-2、19M-2、25M-1、18M-1、DM1；滬釀 3.042米曲霉：中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

黃豆汁固體培養基：將除雜后的黃豆浸泡4 h以上，煮沸5 h，用紗布過濾后取黃豆汁1 L(調整濾液至5 °Bé)，20 g可溶性淀粉，1 g磷酸二氫鉀，0.5 g硫酸鎂，0.5 g硫酸銨，20 g瓊脂，于121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養基：分別稱量80 g麩皮、20 g黃豆粉、80 g 水，混合，浸潤后分裝。

甲醛、二硝基水楊酸試劑(DNS)、福林-酚試劑、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀等化學試劑：均為分析純，購自成都市科龍化學試劑廠，由本實驗室配制。

1.2 主要儀器

GCMS-TQ8040(配有Agilent J & W 高分離度氣相色譜柱，柱長30 m，直徑 0.320 mm，膜0.25 μm)氣質聯用儀 日本島津公司；SWDB204SD-01型分離機 北京中船綠洲機器有限公司；YP20002型電子天平 上海越平科學儀器制造有限公司；752G型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器股份有限公司；BG-160型電熱恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司；PHSJ-4F型pH計 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZF-75L-H型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

2 工藝與方法

2.1 種曲制備

2.1.1 工藝流程

麩皮→加水潤濕→裝入三角瓶→滅菌→接種→培養→種曲。

2.1.2 工藝說明

2.1.2.1 接種、培養

用接種環刮取黃豆汁固體斜面培養基上的米曲霉孢子接種于麩皮培養基中，在30 ℃、濕度80%的條件下培養72 h，得到種曲。

2.1.2.2 種曲酶活測定

在接種時間達到24 h后，每間隔12 h取樣，進行酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶活測定，至72 h結束制曲。

2.2 成曲制備

2.2.1 工藝流程

2.2.2 工藝說明

2.2.2.1 漂燙

脫掉殼的干蠶豆瓣，去除雜質，放入適量沸水漂燙3 min，用冷水冷卻，過濾，備用。

2.2.2.2 接種制曲

加入 17%的面粉(根據干蠶豆質量計算)，接種一定量的種曲以滿足蠶豆混合物中米曲霉量達到 106CFU/g的標準，在濕度90%、30 ℃條件下培養48 h，每12 h翻曲一次。

2.3 甜瓣子的制備

2.3.1 工藝流程

成曲→加入適量鹽水→搖勻→培養→發酵→甜瓣子。

2.3.2 工藝說明

將成曲稱重裝入三角瓶中，備用；將水加熱至80～90 ℃時加入食鹽，配成鹽水，冷卻備用；按成曲與水的質量比為1∶1，將冷卻至40 ℃的鹽水(食鹽水的濃度以最終混合物的食鹽濃度為 15%確定)加入到裝有成曲的三角瓶中，拌和混勻，以紗布和牛皮紙封口，放入37 ℃培養箱中培養30 d。每3 d用無菌玻璃棒攪拌1次，測定其氨基酸態氮、總酸、揮發性風味物質的含量，并對制作成熟的甜瓣子進行感官評價。

2.4 指標測定

2.4.1 蛋白酶和α-淀粉酶

蛋白酶的測定方法：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[6]，進行蛋白酶的測定。

α-淀粉酶的測定方法：參照GB/T 5521—2008《糧油檢驗 谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定 比色法》[7]，進行α-淀粉酶活性的測定。

2.4.2 氨基酸態氮

氨基酸態氮的測定方法：參照GB 5009.235—2016 《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》[8]，進行氨基酸態氮的測定。

2.4.3 總酸

總酸的測定方法：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[9]，進行總酸的測定。

2.4.4 揮發性風味物質

揮發性風味物質的測定方法：采用氣相色譜-質譜法(GC-MS)，測定甜瓣子中揮發性風味物質[10]，相對含量采用內標法進行定量分析，采用3-甲基丁醇為內標物。

2.4.5 感官評定

對甜瓣子進行感官評定，由10名人員組成感官評定小組，取其平均值。擬定的參考評定方法見表 1。

表1 甜瓣子發酵過程中的感官品質Table 1 Sensory quality of sweet beans in the process of fermentation

3 結果與討論

3.1 種曲酸性蛋白酶、中性蛋白酶及α-淀粉酶酶活力測定結果分析

圖1 菌株產酶能力比較Fig.1 Comparison of enzyme production activity of strains

蛋白酶是米曲霉所產酶系中最重要的酶之一，直接影響原料的蛋白質利用率和最終產品的風味[11]。制曲過程中米曲霉產生的淀粉酶系，可將原料中的淀粉質水解成糊精、麥芽糖和葡萄糖，與豆瓣醬的色澤和風味形成有很大關系[12]。由圖1可知，24M-1、BM-2、DM1 3株試驗菌株分別在產酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶方面表現突出，酶活分別為816.809，2168.570，2490.18 U/g，高于3.042的產酶水平。其中，BM-2、24M-1種曲的中性蛋白酶、酸性蛋白酶活力最高，說明菌株產蛋白酶的能力較強，原料利用率更高，發酵周期更短；DM1種曲的α-淀粉酶酶活力最高，說明菌株分解原料中淀粉的能力較強，生成的果糖、葡萄糖等成分為其他微生物的生長提供了物質基礎，對后期發酵過程中風味物質的形成起到關鍵作用。由此，BM-2、24M-1、DM1可作為備選菌株。

3.2 甜瓣子氨基酸態氮測定結果分析

圖2 甜瓣子氨基酸態氮含量對比Fig.2 Comparison of amino acid nitrogen content in sweet beans

甜瓣子制備過程中，依靠米曲霉等微生物在原料上生長繁殖所分泌的蛋白酶，將蛋白質水解為氨基酸類物質，通常以氨基酸態氮表示，是郫縣豆瓣鮮味的主要來源及部分色素(瓣子呈色)的生成基礎，其含量直接影響產品的風味[13]，亦可作為衡量菌株發酵性能的重要指標[14]。由圖2可知，發酵第19天和第29天，BM-2和24M-1的甜瓣子氨基酸態氮含量最高，其次為3.042和DM1。綜合分析，7株試驗菌株中，24M-1、BM-2、DM1發酵甜瓣子的氨基酸態氮含量較高，原料全氮利用率較高，鮮味較足，可作為備選菌株。

3.3 甜瓣子總酸含量測定結果分析

圖3 甜瓣子第19天和第29天總酸含量對比Fig.3 Comparison of total acids content in sweet beans on the 19th and 29th days

甜瓣子發酵過程中，乳酸菌等微生物代謝產生乳酸、乙酸，導致有機酸逐漸積累，酸度逐漸增加。甜瓣子中含有適當的有機酸可增加風味和香氣，但含量過高則會影響蛋白酶、淀粉酶的分解，導致豆瓣呈酸味而影響最終產品品質[15]。由圖3可知，全部菌株發酵甜瓣子中總酸的含量均低于2 g/100 g。綜合分析，7株米曲霉試驗菌株及對照菌株發酵甜瓣子的總酸均較為適宜，對產品品質沒有不良影響。

3.4 甜瓣子中揮發性風味物質測定結果分析

表2 甜瓣子中揮發性成分GC-MS分析結果Table 2 Analysis results of volatile components in sweet beans by GC-MS

續 表

續 表

注：“—”表示未檢出，下同。

由表2可知，8株菌株發酵制備的甜瓣子中共測出65種相對含量較高的揮發性風味物質，其中有醇類15種，酯類23種，酮類7種，醛類7種，酚類4種，酸類4種，烷烴類4種，腈類1種，與已有的研究結果一致[16]。

8個甜瓣子樣品中揮發性風味物質種類對比情況見圖4。

圖4 各甜瓣子中揮發性風味物質種類對比Fig.4 Comparison of types of volatile flavor components in sweet beans

酯類主要由醇類與酸類的酯化反應生成，通常呈現出令人愉悅的甜香及果香，除此之外，酯類還可掩蓋游離脂肪酸帶來的不愉快氣味[17]。由圖4可知，7株米曲霉菌株發酵甜瓣子中的揮發性風味物質種類均高于對照菌株3.042，表現最突出的為DM1，共測出42類揮發性風味物質，其中酯類物質就含有17種，其次為BM-2、24M-1、21M-2。

8個甜瓣子樣品中揮發性風味物質含量對比情況見表3。

表3 甜瓣子主要揮發性風味物質含量對比Table 3 Comparison of content of main volatile flavor components in sweet beans ng/g

醇類是構成郫縣豆瓣特征風味的一類重要化合物，可以被氧化成醛類、酸類等，還是酯化反應的重要前體物質[18,19]。醛類酮類物質通常呈現出令人滿意的甜香及花果香，被認為可以增強食品的風味品質[20]。由表3可知，各甜瓣子中，酮類、酚類的含量相對較高，其中，DM1甜瓣子中這兩類物質含量均為最高，分別為5.31，8.20 ng/g，其次為21M-2甜瓣子，酮類、醇類含量分別達到4.05，5.90 ng/g；揮發性風味物質含量最高的為DM1，達到17.377 ng/g，其次為21M-2，為12.076 ng/g；7株米曲霉試驗菌株中，除19M-2外，其余菌株發酵甜瓣子的揮發性風味物質含量均高于對照菌株3.042。綜合來看，DM1和21M-2在揮發性風味物質方面較為突出，可作為備選菌株。

3.5 感官評定結果分析

對甜瓣子感官品質進行評定，結果見表4。

表4 發酵29 d的8個甜瓣子的感官評定表Table 4 Sensory evaluation of 8 sweet beans fermented for 29 days

由表4可知，8個甜瓣子中，最高分是24M-1樣品88分，其次是DM1、3.042。可知試驗菌株24M-1、DM1發酵制備的甜瓣子感官評價較高，優于對比菌株3.042，可作為備選菌株。

4 結論

本研究以本實驗室分離鑒定得到的7株高產中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶的米曲霉菌株為試驗菌株，以市售3.042米曲霉為對照菌株，分別制備種曲、成曲、甜瓣子，考察了不同菌株發酵的種曲中的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力差別，進一步評價了由上述8株菌株制作的種曲發酵的甜瓣子的氨基酸態氮、總酸、揮發性風味物質、感官評價等發酵特性指標。通過對比分析發現，24M-1、BM-2、DM1 3株菌株分別在產酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等方面表現突出，甜瓣子中氨基酸態氮含量較高；全部菌株發酵甜瓣子中總酸的含量均較為適宜，對產品品質沒有不良影響；揮發性香味物質方面，通過GC-MS方法共分離鑒定出65種主要的揮發性化合物，酮類、醇類的含量相對較高，表現最突出的為DM1，共測出42類揮發性風味物質，酯類達17種；感官評價方面，24M-1、DM1的感官評價最高，優于對比菌株3.042。總體來看，編號為24M-1、DM1的兩株菌在種曲酶活力和甜瓣子的氨基酸態氮、總酸、揮發性風味物質及感官評價等方面表現優異，在提高原料利用率、加快發酵周期、提升豆瓣醬品質方面有較好的應用前景，可進一步優化培養條件和發酵工藝參數，并盡快應用于郫縣豆瓣加工，改變目前產業專用生產菌株缺乏的局面。