東北地方特色大醬標準化工藝研究

陳濟洋，魏登，牟賀，張雷

(吉林農業科技學院 食品工程學院，吉林 吉林 132101)

東北大醬，又稱東北農家醬，因其有特殊味道又稱臭醬，是東北地區特有的一種調味醬，尤其以農村地區最為普遍，近年來，隨著旅游業的發展，東北地區的冰雪旅游發展迅速，吸引了大量滑雪旅游愛好者，臭醬作為地道的東北傳統調味品被放到了餐桌上，成為外地游客喜愛的調味品和必帶禮品。臭醬是豆類釀造食品，主要原料為當地種植的黃大豆，東北土地資源遼闊且土壤肥沃，有機質含量豐富，農作物營養豐富，因此黃豆種子中含有大量蛋白質、脂肪、卵磷脂、礦物質等。由黃大豆經發酵加鹽調味制作而成，可調節食物咸淡，在營養方面，能補充人體所需的植物蛋白，可促進血液循環；發酵后的大醬富含賴氨酸，是人體必需氨基酸，可彌補長期以米類為主食的人群所缺乏的氨基酸，均衡飲食結構；大醬中含有豐富的不飽和脂肪酸，可阻止亞麻酸在機體內部沉積，使血液循環速度增加[1]。由于東北大醬以農村家庭生產為主，生產過程存在問題：沒有嚴格的工藝流程和具體量化的配方，使大醬品質不穩定；傳授方式以父輩傳子輩為主，百家有百種味道；受環境限制，沒有規范的操作流程，容器沒有經過高溫殺菌，存在安全隱患；未經殺菌的大醬在貯藏過程中易受污染，保存難度增加，外地游客尤其是東北地區滑雪旅游愛好者作為禮品不易攜帶和保存。

目前市場包裝售賣多以黃豆醬豆瓣醬為主，這些調味醬大多咸中帶甜，豆瓣清晰可見，醬的研究也多以鮮甜口味的黃豆醬為主，近年來，在黃豆醬制作基礎上，通過在制曲過程中加入不同原料改善醬的口感、營養成分的研究越來越多[2]。而東北傳統大醬因制作方式、地理環境等因素限制，在工藝方面很少有研究。本文通過單因素試驗結合響應面優化法[3]，確定東北大醬的工藝，在制曲階段優化并確定米曲霉接種量、制曲時間、制曲溫度3個要素標準，在后發酵階段[4]，通過添加不同鹽水濃度進行試驗，選取最優的鹽水添加量，使東北大醬鮮咸適中，營養成分充足，大醬的品質穩定，為東北大醬的開發。生產和推廣提供工藝基礎，結合東北地區冰雪旅游經濟發展，使其成為地方特色調味品成為旅游者的餐桌食品和必帶禮品，促進地方冰雪旅游經濟發展。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

黃大豆：新鮮，有豆香味且有光澤，顆粒飽滿，無霉斑，無蟲洞；食鹽；米曲霉滬釀3.042，以上產品均為市售。

1.1.2 試劑與設備

氫氧化鈉試劑(化學純)、酚酞指示劑、甲醛、堿性蛋白酶試劑、三氯醋酸、酪蛋白：吉林市物華玻化試劑有限公司。

XFS-280MB自控型高壓蒸汽鍋 紹興市景邁儀器設備有限公司；721G可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；LH312型搗碎機 中山市綠航電器有限公司；鋁盤、陶瓷壇 市售。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

黃豆泡發→蒸煮→冷卻→瀝水→搗碎→接種(米曲霉)→制醬塊→制曲→成曲→清洗醬塊→切小塊→加食鹽→攪打、撇浮沫→發酵→包裝→殺菌→成品。

1.2.2 操作要點

大豆選擇同年新收獲的黃大豆，必須先將干癟、無光澤或有霉斑、蟲蛀的挑出，避免發霉黃豆影響大醬品質以及發生食品安全問題[5]，剩余顆粒大小均勻、顏色橙黃且表皮完整平滑的黃豆用清水洗去表面灰塵，放入容器內，加入3～4倍體積清水浸泡6～8 h，使黃豆體積漲大至原來的2～3倍，使表面圓潤光滑、無褶皺[6]。浸透完全的黃豆投放進高壓蒸汽鍋，在0.1～0.15 MPa進行蒸煮。蒸煮后的黃豆體積變大，黃豆完整，用手輕輕碾壓可以碾成無堅硬顆粒的泥狀。蒸煮完全的黃豆全部制成泥狀，取出晾涼。

1.2.2.1 制曲

晾涼的黃豆泥接種米曲霉。將米曲霉與黃豆泥充分翻拌混合均勻，再次攪拌，直至米曲霉均勻分布。接種完畢后將原料制成厚度為10～12 cm的長方體醬塊，放入消毒滅菌鋁盤中晾涼。醬塊溫度維持在28 ℃、每間隔6～12 h查看醬塊并翻面，當醬塊每一面表面生成黃綠色孢子時表示制曲完成，可得到具有特殊風味的大醬成曲[7]。

1.2.2.2 處理醬塊

醬塊放入水池，準備硬毛刷把醬塊表面的黃綠色孢子刷洗干凈，至露出棕黃色醬塊本體顏色，晾至醬塊無水滴滴落，醬塊盡量切成小塊，避免后期發酵時醬體不好搗開，容易形成大的顆粒而影響口感。

1.2.2.3 發酵

處理后醬塊放入殺菌后的容器中，用熱水將鹽充分溶解，晾涼至50 ℃得到12%濃度的鹽水，鹽水與醬塊攪拌混合均勻，用防灰通風的棉白紗布封口。放在陽光充足、通風良好的空曠處發酵，每天用醬耙攪打一次醬缸，目的：醬塊打碎使大醬無顆粒，口感細膩，醬塊未清洗干凈的孢子和雜物帶出大醬表面并除掉[8]，發酵30 d。

1.3 試驗設計

1.3.1 制曲工藝優化試驗

1.3.1.1 單因素試驗確定制曲工藝

利用已蒸煮冷卻后的黃豆作為原料進行接種制曲，測定成曲的蛋白酶活性，單因素所選取條件和水平見表1。

表1 大醬制曲工藝試驗因素水平表Table 1 The experimental factors and levels of koji-making process of doenjang

選取1000 g經過預處理的黃豆，通過檢測米曲霉接種量、制曲時間、制曲溫度對蛋白酶活力的影響，每組試驗重復3次，制曲結束后，選用福林-酚法計算酶活，根據蛋白酶活力高低選取因素區間。

1.3.1.2 響應面法優化制曲工藝試驗

以米曲霉接種量(A)、制曲時間(B)、制曲溫度(C)為影響因素，蛋白酶活性為響應值Y，從以上單因素試驗中可以確定大醬發酵過程中3個影響因子的最佳工藝條件范圍，采用Box-Behnken中心組合原理進行設計，建立數學模型，應用Design Expert軟件進行響應面結果分析[9]，得到東北大醬最佳制曲工藝參數。

1.3.2 制醬工藝標準化試驗

以食鹽添加量、發酵時間、發酵溫度為單因素試驗，在此基礎上進行正交試驗，正交試驗設計采用L9(33)正交試驗表，確定提取的最優條件。結合感官評價表，對大醬的色澤、滋味、氣味、形態進行綜合評分，確定最佳標準工藝參數，感官評價標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.3 測定方法與計算

采用福林-酚法測定蛋白質：酶活準備試驗使用福林-酚試劑、pH 7.2緩沖溶液、酪蛋白溶液。先進行福林-酚比色條件試驗：將配制好的試劑放入40 ℃水浴鍋內，1 cm比色杯，用可見光分光光度計測定，制作曲線。蛋白酶活力計算公式如下：

1.4 質量標準檢測

氨基酸態氮的測定：參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》。總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；菌落總數的測定：參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》；大腸桿菌的測定：參考GB 4789.3—2010《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》；致病菌的測定：依據SN/T 2641—2010的方法測定[10]。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶活力測定

采用福林-酚法，以酪氨酸制作標準曲線。

2.2 制曲工藝試驗結果分析

2.2.1 單因素試驗結果分析

2.2.1.1 米曲霉接種量對蛋白酶活力的影響

原料比例：黃豆1000 g，制曲時間36 h，制曲溫度28 ℃，測定接種不同數量米曲霉中蛋白酶酶活，結果見圖1。

圖1 米曲霉接種量對蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum size of Aspergillus oryzae on protease ability

由圖1可知，蛋白酶活力波動受米曲霉接種量影響很大，波動最明顯的是接種量在25%～35%，隨著米曲霉接種量不斷增加，蛋白酶活力也明顯升高，蛋白酶酶活達到最大值1482 U/g，此時米曲霉接種量為0.35%；而繼續加大米曲霉接種量后，菌群總體數量增加，大豆質量不變，大豆所提供的能量及營養有限，米曲霉生長繁殖需大量養分，而基質中所含營養物質以及氧氣供給不是，米曲霉之間生存競爭變大，導致個體菌體生長受到影響，孢子成熟度降低，導致蛋白酶產量下降，影響蛋白酶酶活，因此，接種0.35%米曲霉最佳。

2.2.1.2 制曲時間對蛋白酶活力的影響

原料比例：黃豆1000 g，以制曲溫度28 ℃，米曲霉接種量0.35%，以制曲時間作為變量，蛋白酶酶活為檢驗標準，結果見圖2。

圖2 制曲時間對蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making time on protease ability

由圖2可知，在制曲前48 h，蛋白酶產量呈直線上升趨勢，在第48 h產生蛋白酶量達到頂峰，為1476 U/g；隨制曲時間增長,米曲霉產量大量增加，導致基質養料供給不足，進而抑制蛋白酶活力，并且隨時間增加蛋白酶進行自溶和分解，蛋白酶產酶量逐漸下降，綜合考慮，制曲最適時間為48 h。

2.2.1.3 制曲溫度對蛋白酶活力的影響

原料比例：黃豆1000 g，接種0.35%米曲霉，制曲時間48 h，以制曲溫度作為變量對蛋白酶活力進行測定，結果見圖3。

圖3 制曲溫度對蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making temperature on protease ability

由圖3可知，蛋白酶的產酶量上升速度較快的溫度區間為28～36 ℃。28 ℃之前，溫度較低，米曲霉生長緩慢；當制曲溫度為32 ℃時，蛋白酶活性最高，為1452 U/g；隨著制曲溫度的增加，米曲霉生長困難，并且曲中氧氣越來越稀薄，米曲霉作為好氧型菌株，生長會困難，導致蛋白酶產酶量逐漸下降。最合適制曲溫度為32 ℃。

2.2.2 響應面法試驗結果分析

2.2.2.1 響應面法試驗設計及回歸方程的確立

對上述試驗結果進行分析，可知米曲霉接種量(%)、制曲時間(h)以及制曲溫度(℃)對蛋白酶活力(U/g)有明顯影響，因此，米曲霉接種量、制曲時間和制曲溫度為以自變量，蛋白酶活力為響應值，建立模型對數據進行分析，研究3個自變量因素與蛋白酶活力之間的交互關系，應用SAS軟件中的Box-Behnken方法設計三因素三水平的響應面試驗分析，其因素和水平見表3。

表3 試驗因素和水平Table 3 The experimental factors and levels

以蛋白酶活力作響應值進行響應面優化，優化結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface test design and results

對表4中數據應用響應面回歸擬合分析可知制曲過程中蛋白酶活力主要受到3個因素影響A，B和C與蛋白酶活力Y之間關系的回歸方程如下:

Y=1471.40+39.50A+62.38B+17.13C+20.00AB+58.00AC+53.75BC-191.33A2-208.08B2-115.57C2。

2.2.2.2 二次回歸模型方差分析結果

建立模型，對回歸方程進行各項分析，結果見表5。

表5 二次回歸模型方差分析Table 5 The Variance analysis of quadratic regression model

續 表

由表5可知，米曲霉接種量(A)、制曲時間(B)、制曲溫度(C)3個因素與蛋白酶活力(Y)之間關聯高度顯著，其中A、C、A2、B2、C3對蛋白酶活力有高度顯著影響(P<0.01)，B、AC、BC對蛋白酶活力有顯著影響(P<0.05)，能夠對相應數值預估，證實各自變量與因變量之間關聯存在復雜線性關系，且每個因素對響應值蛋白酶活力(Y)存在很大影響，證明此次制曲工藝試驗設計方案正確；失擬項P值為0.9942(P>0.05)，波動變化較小，說明此方程準確度高，模型有較高擬合度，在不同環境下對蛋白酶活力能做出預測；從F值分析，此模型對制曲工藝中蛋白酶活力影響趨勢為B>A>C，說明在本次試驗中對蛋白酶活力影響最明顯的是制曲時間，米曲霉接種量次之，溫度對制曲影響最小；從回歸方程中可知R2=0.9944，RAdj2=0.9873，R2與1接近，這表明只有1%蛋白酶活力變化未在該模型中分布，只有1%的總變異度不能用該模型解釋；所以該回歸模型有較高的擬合度。

2.2.2.3 響應面分析

在東北大醬制曲工藝環節各因素之間存在交互關系，為更清晰表達這種作用，依據上述數據繪制等高線和響應面，見圖4～圖6。

圖4 米曲霉接種量和制曲時間對蛋白酶 活力的影響曲線圖Fig.4 The contour and response surface diagrams of the effect of inoculum size of Aspergillus oryzae and koji-making time on protease ability

圖5 米曲霉接種量和制曲溫度對蛋白酶 活力的影響曲線圖

圖6 制曲時間和制曲溫度對蛋白酶活力的影響曲線圖Fig.6 The contour and response surface diagrams of the effect of koji-making time and koji- making temperature on protease activity

由圖4～圖6可知，該模型中，A、B、C對蛋白酶活力均有影響，但B的影響最大，A次之，C的影響最小，圖4和圖6表明，AC、BC兩個組合之間存在顯著交互作用(p<0.05)，米曲霉接種量和制曲時間(AB)交互作用不明顯(p>0.05)。圖4～圖6分析結果與方差分析結果一致。

2.2.3 驗證試驗結果

依據上述試驗以及相關計算結果，得到東北大醬制曲過程較佳工藝為：預處理好的黃豆接種0.36%米曲霉，在恒溫32.4 ℃條件下放置49.97 h，預測蛋白酶活力為1481.15 U/g，但結合今后再生產過程中的加工和可行性要求，改進制曲工藝條件：接種米曲霉0.36%，在恒溫33 ℃條件下放置50 h，并以改進后的制曲條件重復3次試驗進行驗證，最后試驗可測得蛋白酶活力為1485 U/g，與預測值相似，證實響應面法優化制曲工藝的正確與真實。

2.3 制醬工藝標準化試驗結果分析

2.3.1 單因素試驗結果分析

2.3.1.1 鹽水添加量對醬品質的影響分析

在已確定的制曲工藝基礎上，分別添加100%、110%、120%、130%、140%的溫鹽水，發酵溫度保持在28 ℃，發酵25 d，以感官評分為指標，選擇大醬發酵過程中鹽水的最佳添加量，試驗結果見圖7。

圖7 鹽水添加量對醬品質的影響Fig.7 Effect of brine additive amount on the quality of sauce

由圖7可知，當鹽水添加量為110%～120%時，醬口味變咸，滋味醇厚，醬體粘稠合適，香氣濃郁，繼續增加鹽水添加量，醬體太稀，咸味過重。因此，宜選取鹽水添加量為110%、120%、130%進行正交試驗。

2.3.1.2 發酵時間對醬品質的影響分析

在確定鹽水添加量的基礎上，在成曲溫度為28 ℃的條件下分別發酵19,22,25,28,31 d，以感官分值為指標，確定最佳發酵時間，發酵時間對醬品質的影響見圖8。

圖8 發酵時間對醬品質的影響Fig.8 Effect of fermentation time on the quality of sauce

由圖8可知，當發酵22～25 d時，豆醬色澤從暗到明亮有光澤，醬體鮮艷；呈棕黃色，醬香濃郁，尤其具有東北農家醬的異香；滋味醇厚綿長。25 d以后，色澤逐漸變暗，產生酸臭味，因此宜選擇發酵時間為22，25，28 d進行正交試驗。

2.3.1.3 發酵溫度對醬品質的影響分析

在已確定的鹽水添加量、發酵時間的基礎上，將成曲分別在24，26，28，30，32 ℃的條件下進行發酵，以感官評分為指標，確定大醬最佳發酵溫度，發酵溫度對醬品質的影響見圖9。

圖9 發酵溫度對醬品質的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on the quality of sauce

由圖9可知，當溫度在26～28 ℃時，醬體色澤明亮，稀稠度適宜，口感醇厚，香味濃郁，異香突出；28 ℃后，醬體色澤逐漸變暗，出現不良氣味，口感變差，因此應選擇26，28，30 ℃進行正交試驗。

2.3.2 大醬標準化工藝條件的確定

2.3.2.1 正交試驗設計

根據2.3.1單因素試驗結果，確定出3個影響因素，即鹽水添加量、發酵時間和發酵溫度，在此基礎上進行正交試驗，正交試驗設計采用L9(33)正交試驗表，所選因素水平見表6，正交試驗結果見表7。

表6 正交試驗因素水平表Table 6 Orthogonal experimental factors and levels

表7 正交試驗結果表Table 7 Orthogonal experimental results

2.3.2.2 正交試驗結果分析

由表7可知，最佳工藝配方為A2B2C2，進行極差R值分析，各影響因素主次順序是：鹽水添加量(A)>發酵時間(B)>發酵溫度(C)。表明鹽水添加量對醬品質影響較大，發酵時間和發酵溫度對醬品質影響較小。極差結果表明A2B2C2在正交表中9組中未出現，從試驗綜合得分可以看出，5號試驗為最優組，需要對5號試驗和極差分析得到的最佳工藝組合再次進行驗證試驗。

經驗證試驗分析，東北地方傳統大醬較佳工藝條件為A2B2C2，其感官評分分別為93分和91分，因此，大醬標準化工藝為A2B2C2，即鹽水添加量為120%，發酵時間為25 d，發酵溫度為28 ℃。

2.4 理化及微生物檢測

氨基酸態氮(g/100 g)≥0.5，實際值為0.83 g/100 g，醬味最濃，鮮味突出，口感濃郁醇厚。總酸檢測實際值為1.25%，無明顯酸味，口感濃郁；菌落總數≤5000 CFU/g，實際值為3200 CFU/g，符合國家標準；大腸桿菌≤30 MPN/100 g；致病菌：未檢出。

3 結論

以傳統東北農家大醬制作工藝為基礎，研究東北大醬的標準化工藝，以米曲霉接種量、制曲時間、制曲溫度為單因素，以試驗形式確定各因素對蛋白酶活力的影響，確定最佳制曲工藝條件：米曲霉接種量1550.36%、制曲時間49.97 h、制曲溫度32.4 ℃，預測蛋白酶活力為1481.15 U/g，結合考慮生產過程中的加工和可行性要求，優化制曲工藝條件為米曲霉接種量0.36%、制曲時間50 h、制曲溫度33 ℃，此條件下蛋白酶活力為1485 U/g；利用單因素和正交試驗對制醬工藝進行確定，得大醬標準化工藝為：鹽水添加量為120%，發酵時間為25 d，發酵溫度為28 ℃。成品大醬色澤棕黃，醬香濃郁，咸鮮適宜，無顆粒，狀態穩定。