接種乳酸菌制作發酵型甘藍泡菜過程的研究

隋明，李俊儒，張鳳英，吳霞，謝慧蓉，楊晨

(1.四川工商職業技術學院，四川 都江堰 611830；2.加拿大阿爾伯塔大學 農業與食品營養科學學院，埃德蒙頓 加拿大 T6G2R3)

甘藍尤其是羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar. acephala f. tricolor)是一種口感香脆、營養豐富的蔬菜，其含有Fe、Ca和胡蘿卜素、VC等多種微量元素以及礦物質[1]。此外，甘藍類蔬菜還含有比其他蔬菜更高含量的蛋白質，被認為是可食用率高、纖維素含量豐富、食用范圍最廣的蔬菜之一[2]。將蔬菜做成泡菜不僅可以佐餐，還能夠減少因萎蔫、腐爛導致的浪費，而且有關研究人員發現泡菜還有一些特殊的功能如其可以逆轉脫發等[3]。但因泡菜的生產工藝及原材料等方面原因，制作具有較好香氣[4,5]和口感的健康泡菜取決于很多因素如：優良的乳酸菌菌種、亞硝酸鹽含量的控制等[6,7]，尤其優良的發酵菌種是至關重要的，其次是不同的發酵條件對泡菜產品的硝酸鹽、總酸、風味化合物等物質生成的影響成為目前泡菜研究中的主要課題[8]。泡菜發酵的基本原理是：首先，將乳酸菌加入到發酵陶壇中，再加入經過前處理的蔬菜，使發酵蔬菜具有獨特的風味和口感；其次，加入食鹽，均勻滲透到蔬菜內部，使組織內的水分被滲透壓調整，提高脆度和口感等；最后，通過發酵過程中的各種物理和化學過程，該反應產生泡菜產品的獨特風味、顏色和質地。目前泡菜的生產與加工幾乎都是通過人工接種，可以將發酵基質中的乳酸菌形成優勢菌，避免雜菌的生長[9]。

本試驗通過以羽衣甘藍為泡菜的主要原料輔以其他佐料，通過接種乳酸菌考察了在自然發酵和接種發酵條件下亞硝酸鹽含量、pH、酸價的變化，以期通過對照，確定羽衣甘藍泡菜發酵的最佳工藝參數。

1 試驗材料

1.1 試驗材料

甘藍：都江堰市售羽衣甘藍；純凈水：都江堰藍光純凈水廠；泡菜鹽(川晶泡菜鹽)：四川鹽業總公司；冰糖(千柏山牌單晶水塘)：云南綾悅軒食品有限公司；生姜(都江堰市售干姜)、胡椒粉(醇禾白胡椒粉)：泰州市永泰食品有限公司；冰乙酸：天津致遠化學試劑有限公司；亞硝酸鈉標準品：中科北京儀器耗材標準物質中心。

1.2 接種泡菜發酵工藝

試驗的接種型泡菜甘藍制作流程圖見圖1。將羽衣甘藍洗凈、瀝水，切成2 cm×5 cm小長條，在烘箱中在40 ℃條件下烘干，烘干后放入已經接入乳酸菌(植物乳桿菌/鼠李糖乳桿菌)的泡菜陶壇中，進行泡菜發酵。

圖1 泡菜工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of pickle

2 試驗方法

將泡菜在自然發酵條件下進行發酵，并在30 ℃下采用接種乳酸菌的方式進行發酵，兩者做對照比較相關指標。分別考察發酵5 d、不同菌種比例、不同接種量、發酵溫度、蔗糖添加量和食鹽添加量對甘藍泡菜基質中亞硝酸鹽含量、pH和酸價的影響。

2.1 亞硝酸鈉測定方法

參照國家標準GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，使用離子色譜法進行測定，取部分甘藍泡菜試樣經沉淀蛋白質、除去脂肪后，采用相應的方法提取和凈化，以KOH為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導檢測器或紫外檢測器檢測，以保留時間定性，外標法定量。

2.2 總酸含量測定方法

參照國家標準GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采集泡菜樣品不少于200 g，放置于組織攪碎機中，加入與樣品等量煮沸過的純凈水，用研缽搗碎，混合均勻后放置在潔凈的燒杯中，從中精確取出50.000 g樣品，用煮沸的水將燒杯中內容物全部轉移到250 mL容量瓶中，放置于沸水浴中煮沸，并搖動若干次，用快速濾紙過濾，收集濾液，用于測定。

3 結果與討論

3.1 自然發酵與接種乳酸菌發酵的前期時間比較

在自然富集菌種和接種乳酸菌的甘藍泡菜發酵5 d后，測定亞硝酸鹽含量、pH值和總酸，結果見表1。

表1 天然發酵和接種發酵之間的指標比較Table 1 Comparison of indexes between natural fermentation and inoculation fermentation

由表1可知，發酵5 d后人工接種發酵泡菜基質中的亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵，pH值也低于自然發酵，總酸量小于自然發酵。亞硝酸鹽是一種致癌化學物質，是發酵類型食品能否出廠的一個重要指標，通過自然發酵獲得的泡菜產品具有高亞硝酸鹽含量。通過本小節試驗可以得出結論，為了保證泡菜產品的安全性，應選擇人工接種發酵。賈慶超等模擬了自然發酵的條件下發酵不同類型蔬菜，通過考察不同發酵時間內的亞硝酸鹽含量，確定其適合食用的時間和亞硝酸鹽變化規律[10]，其試驗結果表明不同類型的蔬菜在冷藏相同時間內硝酸鹽含量是不同的，苤藍泡菜中亞硝酸鹽含量較低。而周強通過考察大白菜發酵過程中不同時間內亞硝酸鹽含量，發現總酸、亞硝酸鹽含量均在發酵的第5天或第7天出現最高值[11]，該試驗結果同本試驗結果相同，說明發酵型泡菜在發酵5～7 d時不宜食用。

3.2 不同菌株配比對泡菜發酵的影響

分別向甘藍泡菜基質中接入鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌的比例，考察甘藍泡菜成品的顏色、香氣、味道和質地的評分，確定接種菌株的比例。

表2 不同菌株的泡菜質量綜合評分表Table 2 Comprehensives scoring table of pickle quality fermented by different strains

圖2 不同菌株的比例對泡菜質量的影響Fig.2 Effect of the proportions of different strains on the quality of pickle

由表2和圖2可知，在鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的接種率為1∶0、1∶1、0∶1的情況下發酵泡菜，并對產品進行感官評價。結果發現，當接種率為1∶1時，泡菜的味道最好。當兩種菌株混合接種時，發酵速度加快，乳酸菌產生乳酸的速度增加，pH值加快，泡菜產品香氣濃郁，口感好。苗鐘化[12]對比了泡菜直投菌同鼠李糖乳桿菌GG對因抗生素導致的小鼠腸胃紊亂的效果，發現兩種條件下制作的泡菜均有改善的效果。任大勇等[13]發現植物乳桿菌對辣白菜泡菜中風味物質的生成及菌群結構有著明顯的影響，其能夠導致菌落豐度降低，總酸含量在第5天達到最高，但總體上可以縮短發酵時間。而本試驗使用的兩種菌均為前人實驗得到較好的發酵效果，如李霜等[14]從市售泡菜中分離到一株可以降解亞硝酸鹽的植物乳桿菌SA-4(LactobacillusplantarumSA-4)，其采用該菌株發酵泡菜可以顯著降低泡菜基質中的亞硝酸鹽。凌潔玉等[15]也通過實驗證實了植物乳桿菌具有降解亞硝酸鹽的作用，因此說明該屬菌株可以作為發酵泡菜的一種直投菌株。

3.3 接種量對泡菜接種和發酵的影響

在本小節試驗中采用鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的情況下，分別考察成品甘藍泡菜的顏色、香氣、味道、質地情況，對其進行評分(見表3)，同時以發酵泡菜基質中的總酸和pH為指標，測定了在不同接種量的情況下兩種指標發生的變化。

表3 泡菜的不同接種量的綜合評分表Table 3 Comprehensive scoring table of pickle with different inoculum size

圖3 不同接種量對總酸和pH的影響Fig.3 Effect of different inoculum size on total acid and pH

由圖3可知，接種量對泡菜的質量有很大影響。較小的接種量導致較長的發酵時間，造成發酵基質出現較低總酸和較高pH的情況，影響產品生產率和發酵周期。當接種量過大時，乳酸菌的生長速度過快，會增加產品乳酸，導致總酸過高，pH值過低，滋味較差，其他次生代謝廢物的產量也增加。在該試驗中，進行了接種量為1%、2%、3%、4%和5%的泡菜產品的感官評價。綜合分析表明，當接種量為3%時，發酵得到的泡菜質量最好。

3.4 溫度對泡菜發酵的影響

在本小節試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%的情況下，分別考察培養溫度為23，30，37 ℃時成品甘藍泡菜的顏色、香氣、味道、質地情況，對其進行評分，同時以發酵泡菜基質中的總酸和pH為指標，測定了在不同溫度情況下兩種指標發生的變化。

表4 不同溫度影響泡菜指標的綜合評分表Table 4 Comprehensive scoring table of pickle indexes affected by different temperatures

由表4可知，泡菜的口感隨著溫度的升高而逐漸增加，并且在約30 ℃時獲得最佳口感，當采用37 ℃發酵時品質會降低，說明溫度是影響泡菜發酵的因素之一。這可能是因為當溫度太低時，乳酸菌的生長速度變慢，泡菜的發酵周期大大增加，同時發酵的泡菜味道不好，質地柔軟。當溫度太高時，乳酸菌的生理活性受到抑制，泡菜顏色被發酵，甚至會有褐變發生。在本小節試驗中，在23，30，37 ℃的溫度下對泡菜產品進行感官評價后，發現發酵溫度控制在約30 ℃時，泡菜的風味良好并且沒有發生褐變。熊濤[16]在不同溫度下以圓白菜為原料考察了發酵過程中發酵基質的pH、微生物等的變化，結果表明溫度越高，發酵基質的pH越低，而當使用較低的培養溫度發酵時，發酵的周期也變長。

3.5 蔗糖添加是泡菜發酵的影響

在本小節試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%，發酵溫度為30 ℃的情況下，分別考察蔗糖添加量為0%、1%、2%、3%、4%時成品甘藍泡菜的顏色、香氣、味道、質地情況，對其進行評分(見表5)，同時以發酵泡菜基質中的總酸和pH為指標，測定了在不同溫度的情況下兩種指標發生的變化。

表5 不同加糖量泡菜質量的綜合評分表Table 5 Comprehensive scoring table of pickle quality with different sugar additive amount

圖4 不同蔗糖添加量對總酸和pH的影響Fig.4 Effect of different sucrose additive amount on total acids and pH

由圖4可知，總酸含量隨著蔗糖含量的增加而增加，pH值隨著蔗糖含量的增加而降低。當蔗糖含量增加時，乳酸菌發酵的乳酸含量也增加，因此pH值降低并且總酸含量增加。當加入的糖量為2%時，顏色鮮艷，味道更好，存在典型的泡菜風味，并且氣味強烈。如果不添加蔗糖，則發酵的泡菜產品不具有良好的口感，并且香氣不濃，pH太高且總酸太低。加入蔗糖后，泡菜的質量不會受到影響，但當蔗糖含量過高時，過多的糖會降低泡菜的酸度，同時增加成本，此時pH較低，味道極佳。因此，根據感官、總酸和pH值的結果分析后得出結論，當加入的蔗糖量為2%時產品最佳。

燕平梅等[17]通過實驗研究了蔗糖對發酵蔬菜品質的影響，其發現在2%濃度下制作的泡菜產品中亞硝酸鹽含量最低，乳酸菌的含量最高，該實驗結果同本小節試驗的結果相同，可以推測在一定條件下，添加2%的蔗糖有利于減少泡菜中的亞硝酸鹽含量，同時還能夠提高蔬菜的脆度和口感以及翠綠的外觀顏色。侯方麗等[18]也使用甘藍作為主要原料考察了不同因素對甘藍泡菜品質的影響，發現當蔗糖添加量為2%時，發酵6 d后亞硝酸鹽含量降低到符合國家標準水平，該結果同本試驗的研究結果相同。

3.6 鹽添加量對泡菜發酵的影響

在本小節試驗中采用鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌為1∶1的比例，在接種量為3%、發酵溫度30 ℃的情況下，分別考察在食鹽添加量為2%、3%、4%、5%、6%的情況下對成品甘藍泡菜的顏色、香氣、味道、質地情況，對其進行評分(見表6)，同時以發酵泡菜基質中的總酸和pH為指標，測定了在不同食鹽添加量的情況下兩種指標發生的變化。

圖5 不同鹽添加量對總酸和pH的影響Fig.5 Effect of different salt additive amount on total acids and pH

在本小節試驗中，當泡菜鹽的添加量為2%、3%、4%、5%、6%時，通過綜合評分評價泡菜產品，并測定總酸和pH。由圖5可知，隨著鹽濃度增加，pH值增加，總酸減少。當鹽濃度為2%時，pH值太低，總酸含量高，成品泡菜的味道太酸，但加入不同食鹽含量發酵的泡菜在感官上差別不大。當鹽含量為3%時，泡菜味道最好，味道鮮脆，香氣濃郁，質地不柔軟，但在此鹽濃度下，pH值也低，總酸度過高，不利于泡菜的貯藏，保鮮期短，容易腐敗，從保質期和貨架期方面來看，應選擇較高的鹽濃度，如4%。但當鹽的濃度太高時，味道過咸，顏色不新鮮，呈現黑黃的狀態，并且隨著鹽濃度增加，pH降低的速率將變慢。此外，鹽濃度過高不利于身體健康。因此，鹽的最佳加入量為4%。

表6 不同加鹽量泡菜質量的綜合評分表Table 6 Comprehensive scoring table of pickle quality with different salt additive amount

王向陽等[19]以蘿卜為主要原料研究了腌制條件對加工工藝和保質期的影響，結果表明：在4%的食鹽添加量時，適合乳酸菌的生長及生成適量的乳酸，而且還能減少引起生花等腐敗菌的繁殖，其也驗證了在泡菜基質中接種植物乳桿菌可以將發酵時間控制在適當的范圍，而且成品的腌蘿卜泡菜口感和風味最好。李軍波[20]通過多項指標考察了食鹽濃度對發酵型泡菜的影響，發現在2%的食鹽添加量時，泡菜中的乳酸菌菌體數量最高，但是發酵泡菜基質中的pH很低；而5%食鹽添加量可以較好地抑制其他腐敗菌的繁殖。該試驗結果同本小節試驗得出的采用4%的食鹽添加量的結論相似。付莎莉等通過試驗研究了不同食鹽濃度對白菜、豇豆、蘿卜3種不同蔬菜發酵制備泡菜的影響，結果表明：在食鹽添加量為6%時，革蘭氏陽性菌占據主要菌群優勢，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是發酵中的有益菌。該結果與本小節試驗結論比較接近，在以蔬菜為發酵原料時，食鹽的最佳添加量約為4%～6%，而且為了保證發酵泡菜能夠含有較低的雜菌數量，在此范圍內適合植物乳桿菌生長。

3.7 接種量對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

在1∶1比例接種量的條件下對泡菜基質亞硝酸鹽含量的影響見圖6。不同的接種水平對泡菜的亞硝酸鹽含量有一定的影響。隨著接種量的增加，亞硝酸鹽含量降低。原因可能是接種乳酸菌后會產生大量的乳酸，這會使亞硝酸鹽還原為無毒物質，也可能是因為接種了大量的乳酸菌，抑制了其他細菌的生長，并減少了硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的量。但當接種量過大時，泡菜的味道會變酸，綜合考慮，當接種量為3%時，亞硝酸鹽含量低，口感最佳。

圖6 不同接種量對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響Fig.6 Effect of different inoculum size on nitrite content in pickle

3.8 溫度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

溫度對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響不是很大，但是當溫度高時，乳酸菌的生長受到抑制，并且大大降低了亞硝酸鹽的還原能力，導致亞硝酸含量增加。當溫度低時，乳酸菌的活性將受到一定程度的抑制。只有當乳酸菌處于最佳溫度時，才適合發酵泡菜，試驗結果見表7。綜合考慮，采用30 ℃的發酵溫度制作甘藍泡菜較為適合。

表7 溫度對泡菜亞硝酸鹽含量的影響Table 7 Effect of temperature on nitrite content in pickle

3.9 不同菌株對泡菜亞硝酸鹽含量的影響

對泡菜的制作影響因素最大的是微生物的作用，本試驗采用接種不同比例的鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌進行發酵甘藍泡菜的試驗，試驗結果見表8。

表8 不同菌株對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響Table 8 Effect of different strains on nitrite content in pickle

當采用鼠李糖乳桿菌單獨接種時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低，此時泡菜的味道不太好；當單獨接種植物乳桿菌時，泡菜的味道變得更好，但亞硝酸鹽含量更高；當兩種菌株組合使用時，泡菜的亞硝酸鹽含量較低，而且還具有良好的口感，因此采用1∶1的比例接種于甘藍泡菜進行發酵結果最好。

李春等[21]證實鼠李糖乳桿菌在一定條件下可以降解亞硝酸鹽，該試驗結果同本試驗結果一致，而且鼠李糖乳桿菌可以抑制黃曲霉等產毒真菌，具有較強的抑制作用[22]。植物乳桿菌具有較強的降解亞硝酸鹽的作用[23]，楊晶等[24]還通過實驗證實其降解亞硝酸鹽與其產酸能力有關，其中蘋果酸和乳酸的效果最明顯。

4 結論

通過單因素試驗確定了接種乳酸菌發酵甘藍泡菜的最佳工藝條件：4%食鹽，3%乳酸菌接種量(30 ℃發酵溫度，2%蔗糖，植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌比例為1∶1)。采用人工接種和發酵的泡菜具有更好的味道，并且亞硝酸鹽含量遠低于標準的20 mg/kg泡菜產品標準。而且接種發酵比自然發酵時間短，可以實現批量化生產，所得產品具有相似的稠度，遠優于自然發酵的泡菜口感和質量。