酶預處理提取茴香揮發油的研究

孟文俊，蘇藝華

(1.滄州職業技術學院 基礎部，河北 滄州 061000；2.滄州師范學院 繼續教育學院，河北 滄州 061000)

茴香為傘形科茴香屬多年生草本植物，具有強烈的香氣，原產于地中海沿岸及西亞，現主要集中產于歐亞大陸。在我國，茴香已有上千年的栽培歷史，廣泛分布于東北、華北和西北地區[1,2]。茴香種子及其揮發油是重要的調味品，在全世界范圍內廣泛使用。此外，茴香揮發油也能藥用，具有抗菌消炎及鎮痛的功效[3,4]。茴香揮發油是無色或淡黃色液體，具有獨特的香味，主要成分是茴香腦和葑酮，以及少量的檸檬烯、蒎烯、γ-松油烯等萜烯類成分[5,6]。現有的茴香揮發油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、蒸餾萃取法、微波輔助法和亞臨界流體萃取法等[7-10]。近年來，酶預處理成為揮發油提取過程中的常用輔助方法，酶預處理可以破壞植物細胞壁，促進細胞活性成分溶出，提高得油率[11]。本文利用纖維素酶預處理后蒸餾提取茴香揮發油，在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗優選最佳工藝，并分析了酶預處理后提取的茴香揮發油的成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

茴香：試驗用茴香產自河北；纖維素酶：產于河北拓海生物科技有限公司，活力單位10000 U/g；檸檬酸、石油醚、無水硫酸鈉：均為分析純。

1.1.2 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器有限公司；QP2010氣相色譜-質譜聯用儀 Shmadzu公司；AB135-S分析天平 Mettler-Toledo公司；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取

將茴香籽粉末50 g置于100 mL燒瓶中，根據試驗設計的需要，加入適量纖維素酶溶液，在一定的溫度和pH條件下預處理一定時間。隨后，利用水蒸氣蒸餾法提取茴香揮發油，蒸餾液以石油醚萃取，加入無水硫酸鈉，靜置，干燥脫水，再使用減壓旋蒸法去除石油醚，得到茴香揮發油。為了對比，不經過酶預處理，利用相同方法提取茴香揮發油。稱重，計算茴香揮發油的得油率。

1.2.2 單因素試驗

設定纖維素酶的添加量為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，預處理溫度為50 ℃，調節pH值為5，預處理時間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發油，并計算得油率；設定纖維素酶的添加量為1.5%，分別設定預處理溫度為40，45，50，55，60，65 ℃，調節pH值為5，預處理時間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發油，并計算得油率；設定纖維素酶的添加量為1.5%，預處理溫度為50 ℃，分別調節pH值為3.5，4，4.5，5，5.5，6，預處理時間為4 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發油，并計算得油率；設定纖維素酶添加量為1.5%，預處理溫度50 ℃，調節pH值為5，分別預處理1，2，3，4，5，6 h，隨后參照1.2.1中的蒸餾法提取茴香揮發油，并計算得油率。

1.2.3 正交試驗

根據單因素試驗結果，以茴香揮發油的得油率為考察指標，選取纖維素酶添加量(1%、1.5%、2%)、預處理溫度(45，50，55 ℃)、預處理pH值(4.5，5，5.5)、預處理時間(3，4，5 h)4個因素設計L9(34)正交試驗。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 纖維素酶添加量對揮發油得油率的影響

茴香揮發油得油率與纖維素酶添加量的關系見圖1。

圖1 茴香揮發油得油率與纖維素酶添加量的關系Fig.1 The relation between the yield of fennel volatile oils and the additive amount of cellulase

由圖1可知，未添加纖維素酶時，揮發油的得油率最低，隨著纖維素酶添加量的增加，揮發油得油率快速增加，但當纖維素酶的添加量超過1.5%時，進一步增加纖維素酶添加量，揮發油得油率增加緩慢，甚至不再變化。這是由于茴香籽與纖維素酶已經結合，繼續增加纖維素酶的添加量，已經沒有多余的底物能夠與其結合，揮發油提取率幾乎不再改變[12]。

2.1.2 纖維素酶預處理溫度對揮發油得油率的影響

茴香揮發油得油率與預處理溫度的關系見圖2。

圖2 茴香揮發油得油率與酶預處理溫度的關系Fig.2 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment temperature

由圖2可知，隨著酶預處理溫度的升高，茴香揮發油的得油率明顯增加，但當溫度超過50 ℃時，繼續升高酶預處理溫度，揮發油的得油率反而下降，這是由于溫度過高時，纖維素酶的活性降低，從而導致茴香揮發油的得油率降低。

2.1.3 纖維素酶預處理pH值對揮發油得油率的影響

茴香揮發油得油率與酶預處理pH值的關系見圖3。

圖3 茴香揮發油得油率與酶預處理pH值的關系Fig.3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment pH value

由圖3可知，隨著pH值的增加，茴香揮發油的得油率明顯上升，當酶預處理pH值達到5時，茴香揮發油的得油率最高，進一步增加pH值，得油率明顯下降，這種變化趨勢可能與纖維素酶的最佳pH值有關，pH值過高或過低都會影響纖維素酶的活性[13]。

2.1.4 纖維素酶預處理時間對揮發油得油率的影響

茴香揮發油得油率與酶預處理時間的關系見圖4。

圖4 茴香揮發油得油率與酶預處理時間的關系Fig.4 The relation between the yield of fennel volatile oils and the enzyme pretreatment time

由圖4可知，隨著酶預處理時間的增加，茴香揮發油的得油率明顯增加，當預處理時間超過4 h時，進一步增加預處理時間，揮發油的得油率幾乎不再變化[14]。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗的結果，對影響茴香揮發油得油率的主要影響因素：纖維素酶添加量、酶預處理溫度、酶預處理pH值和酶預處理時間，采用正交試驗對酶預處理條件進行優化。因素水平設計見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗方案與結果Table 2 Orthogonal experimental scheme and results

由表2可知，各因素對茴香揮發油得油率的影響大小依次為A>B>C>D，即纖維素酶添加量對茴香揮發油得油率的影響最大，其次為酶預處理溫度、酶預處理pH值，酶預處理時間對得油率的影響最小。在選定的水平中，各因素的最優水平為A2B2C2D3，即纖維素酶添加量為1.5%，酶預處理溫度為50 ℃，酶預處理pH值為5，酶預處理時間為5 h。試驗驗證結果表明，在最優提取條件下，茴香揮發油的得油率可達1.69%，高于正交試驗的所有結果。

2.3 不同預處理方法對茴香揮發油得油率的比較

不同預處理方法對茴香揮發油得油率的比較見表3。

表3 茴香揮發油得油率與預處理方法的關系Table 3 The relation between the yield of fennel volatile oils and the pretreatment methods

由表3可知，對纖維素酶預處理最佳提取工藝組合進行預處理，茴香揮發油得油率最高，達到1.68%，高于不添加纖維素酶和不做預處理的提取方式。

2.4 不同預處理方法對茴香揮發油成分的影響

不同預處理方法的茴香揮發油主要成分見表4。

表4 茴香揮發油的主要成分表Table 4 The main components of volatile oils of fennel %

纖維素酶預處理對茴香揮發油成分的影響較大，反式-茴香腦和含氧化合物的比例均高于未做預處理的茴香揮發油，香味更加明顯。總的來說，經過酶預處理后的茴香揮發油具有更好的品質[15]。

2.5 不同預處理方式下細胞壁的形貌表征

不同預處理方式后細胞壁的SEM圖片見圖5。

圖5 不同預處理方式后細胞壁的SEM圖片Fig.5 The SEM figures of cell walls with different pretreatment methods

注：a表示未經預處理；b表示溫水浸泡預處理；c表示纖維素酶預處理。

由圖5a和圖5b可知，不經過任何預處理或溫水浸泡預處理后的茴香籽的細胞壁表面由多層保護結構覆蓋，細胞壁難以被破壞或僅只有物理上的破壞，在較長的蒸餾時間下，體內的精油無法被順利提取，揮發油得油率仍然較低。由圖5c可知，纖維素酶預處理后，由于酶解的作用，細胞壁被破壞，體內精油更容易被提取，揮發油得油率增加。

3 結論

利用纖維素酶預處理結合蒸餾法提取茴香揮發油，并利用正交試驗探討了最佳提取工藝。結果表明：纖維素酶添加量1.5%，預處理溫度50 ℃，預處理pH值5，預處理時間5 h時，茴香揮發油的得油率最高，達到1.68%，明顯高于溫水浸泡處理后蒸餾和直接蒸餾法。纖維素酶預處理后提取的揮發油的反式-茴香腦和含氧化合物比例更高，具有更好的品質。纖維素酶預處理能夠破壞茴香籽的細胞壁，使茴香揮發油更容易被提取。