孕激素對不同PGRMC2表達的卵巢癌細胞遷移、侵襲的影響及發生機制

傅 優，鄭 洪，黃佳佳，陶貴珠

用的孕激素受體膜成分(progesterone receptor membrane components,PGRMCs)的表達和功能上[4]。孕激素受體膜成分2(progesterone receptor membrane component 2, PGRMC2)是PGRMCs中的一員。Albrecht等[5]的實驗結果顯示，在卵巢癌SKOV3細胞中PGRMC2的高表達可抑制其遷移，而降低PGRMC2表達水平可促進其遷移。Jühlen等[6]提出PGRMC2的抑制腫瘤轉移作用可能由孕激素介導。另外，研究發現卵巢癌在發生、發展過程中存在Wnt信號通路的異常激活，其中Wnt信號通路相關蛋白β-catenin表達明顯升高[7]。Wnt/β-catenin信號通路的激活促進了癌細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程，從而增強了腫瘤的轉移能力[8]。但是，在卵巢癌中孕激素是否通過PGRMC2介導影響卵巢癌的遷移和侵襲及其與Wnt信號通路的關系尚未見報道。因此，本實驗通過不同濃度孕激素作用于卵巢癌細胞，探討其對卵巢癌遷移、侵襲的影響及可能機制，為開發有效的卵巢癌治療策略和控制其轉移的靶標提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3、HO-8910細胞系分別購于南京凱基生物公司、江蘇齊氏生物公司；BI胎牛血清購于以色列Biological Industries公司；孕激素購于中國Med Chem Express公司；CCK-8試劑盒購于上海Beyotime公司；Transwell小室購于Costar公司；Matrigel基質膠購于BD Biocoat；PGRMC2單克隆抗體購于Santa Cruz公司，鼠抗人內參GAPDH一抗購于上海Beyotime公司，β-catenin單克隆抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及處理 人卵巢癌SKOV3、HO-8910細胞均在含10%胎牛血清、10 000 μ/mL青霉素、10 000 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5%CO2相對飽和濕度條件中培養。待細胞生長融合度達80%左右進行消化、傳代。

1.2.2CCK-8法 采用CCK-8法測定孕激素對卵巢癌細胞存活率的影響。取對數生長期的SKOV3、HO-8910細胞，以每孔5×103個接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2相對飽和濕度條件中培養。待細胞生長融合度達70%～80%，加入不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，每組設3個復孔，同時設置空白組和對照組。作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養箱中孵育2～3 h，用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的光密度(OD)值。

1.2.3Transwell遷移實驗 于小室板下室中加入550 μL的10%含血清培養基，上室(不含基質膠)加入100 μL無血清的細胞懸液(濃度為每毫升5×104個細胞)及不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，各個藥物濃度均由無血清培養基稀釋而成。每個藥物濃度做3個復孔，并設置對照組(100 μL無血清培養基與100 μL的細胞懸液吹打混勻加入Transwell上室)，放入37 ℃、5%CO2的培養箱孵育48 h。取出小室板進行固定染色，中性樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片隨機拍取5個視野，記下每個視野的細胞數并取均值記為一次實驗結果，實驗重復3次，并進行統計學分析。

1.2.4Transwell侵襲實驗 除于小室板上室包被、水化基質膠外，其余步驟均與Transwell遷移實驗相同。

1.2.5Western blot法 取對數生長期的細胞，待細胞長至培養瓶的80%后分別加入同等體積、不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素，并設置對照組。作用48 h后將細胞取出加入裂解液提取蛋白，通過BCA法進行蛋白定量。配膠、上樣、電泳、切膠及電轉，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗PGRMC2(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶7 500)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗孵育2 h，TBST充分洗膜。采用ECL化學發光法曝光顯影。

2 結果

2.1 不同濃度孕激素作用卵巢癌細胞SKOV3及HO-8910后對細胞增殖的影響應用CCK-8法檢測不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素分別作用SKOV3、HO-8910細胞24、48、72 h后觀察細胞的增殖情況。結果顯示，孕激素可抑制卵巢癌細胞的增殖，呈濃度-時間依賴性下降，且對HO-8910細胞抑制增殖的作用較SKOV3細胞明顯(P<0.05，圖1)。同一時間不同濃度(10、20、40 μmol/L)孕激素處理SKOV3、HO-8910細胞后，實驗組與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，各實驗組間存活率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10、20 μmol/L作用SKOV3細胞24 h)。同一濃度不同時間(24、48、72 h)孕激素處理SKOV3、HO-8910細胞后，結果顯示隨著藥物作用時間的延長，孕激素對細胞增殖的抑制作用增強，各實驗組間差異均有統計學意義(P<0.05)(除外10 μmol/L孕激素作用SKOV3細胞24～48 h、作用HO-8910細胞48～72 h)。孕激素作用48 h后，可明顯抑制兩組細胞株的增殖，且兩株細胞間細胞存活率相比，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，采用作用時間為48 h的孕激素用于后續實驗。

2.2 不同濃度孕激素作用卵巢癌細胞SKOV3及HO-8910后對細胞遷移及侵襲的影響應用Transwell法檢測不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910細胞48 h后細胞的遷移及侵襲能力。結果顯示，SKOV3、HO-8910細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數量對照組明顯高于實驗組(P<0.05)(圖2A、B)。同種細胞，癌細胞的遷移能力隨著孕激素濃度的升高而減弱，呈劑量依賴性，各組差異有統計學意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10～20 μmol/L)。相同的藥物作用時間及濃度，SKOV3穿過小室的細胞數量與HO-8910相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果表明，孕激素可抑制SKOV3、HO-8910細胞的遷移和侵襲。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度孕激素對卵巢癌SKOV3(A)、HO-8910(B)細胞增殖的影響

2.3 Western blot法檢測不同濃度孕激素作用卵巢癌細胞SKOV3及HO-8910后對細胞中PGRMC2和β-catenin蛋白表達的影響運用不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的孕激素作用SKOV3、HO-8910細胞48 h后，Western blot結果顯示，SKOV3及HO-8910細胞實驗組PGRMC2蛋白表達水平與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。HO-8910細胞的對照組及實驗組PGRMC2蛋白相對表達量較SKOV3高，差異有統計學意義(P<0.05)。SKOV3及HO-8910細胞實驗組β-catenin蛋白表達水平與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著孕激素濃度的增加，β-catenin的表達降低，各組間差異有統計學意義(P<0.05)(除外孕激素濃度為10～20 μmol/L)，且SKOV3細胞的對照組及實驗組β-catenin蛋白表達水平較HO-8910高，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，孕激素對PGRMC2蛋白表達無影響，但可下調β-catenin蛋白的表達水平，且隨著孕激素濃度的增加，這種下調作用更加明顯。

圖2 Transwell實驗檢測不同濃度孕激素對卵巢癌SKOV3、HO-8910細胞遷移(A)和侵襲(B)能力的影響與同種細胞株中對照組相比，*P<0.05；與同種細胞株中濃度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

圖3 Western blot法檢測不同濃度孕激素作用卵巢癌細胞SKOV3及HO-8910后細胞中PGRMC2和β-catenin蛋白的表達水平

與同種細胞株中對照組相比，*P<0.05；與同種細胞株中濃度10、20 μmol/L相比，#P<0.05

3 討論

由于卵巢癌早期缺乏有效的診療方法，常于轉移階段被診斷出來。轉移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因。大量流行病學調查發現女性口服避孕藥和妊娠可降低卵巢癌的發病率，常規服用含孕激素的口服避孕藥可降低30%的卵巢癌風險[9]。但孕激素對卵巢癌保護作用的分子機制至今尚不清楚。

近年來有研究顯示[10]，孕激素可通過降低ADP-核糖基化因子6(ARF6)、神經前體細胞表達的發育性下調基因9(NEDD9)及膜型1基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)3種蛋白的表達來調節侵入性偽足(invadopodia)的形成，最終抑制子宮內膜癌的遷移和侵襲。另有研究認為[11]孕激素可通過抑制TGF-β/SMAD信號傳導途徑來減弱子宮內膜癌的轉移和侵襲。眾所周知，TGF-β可調節腫瘤細胞的轉移能力，部分原因是其可促進EMT[12]。TGF-β通過SMAD2/3的直接磷酸化，活性SMAD復合物的核轉位以及隨后與其他轉錄因子的相互作用來觸發EMT。Bokhari等[11]研究顯示，孕激素通過上調E-cadherin和下調vimentin的表達來抑制EMT，最終降低子宮內膜癌的遷移、侵襲能力。這與Jeon等[13]提出的觀點一致，認為孕激素通過改變EMT相關標志物的表達來抑制腫瘤細胞的轉移。以上研究均提示了孕激素可能會抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲，但孕激素是否影響卵巢癌細胞的遷移、侵襲及其機制鮮有報道。

本實驗通過不同濃度的孕激素作用于卵巢癌SKOV3、HO-8910細胞，觀察其對細胞增殖、遷移及侵襲的影響。CCK-8結果顯示，孕激素(10～40 μmol/L)作用24、48、72 h后均可抑制兩株細胞的增殖。綜合兩株細胞的增殖情況，實驗采用作用時間為48 h的孕激素用于后續實驗。Transwell遷移、侵襲實驗顯示，孕激素作用后的細胞遷移能力較對照組明顯降低，且隨著孕激素濃度的增加，同種細胞的遷移、侵襲能力降低，呈劑量依賴性。這提示孕激素可抑制卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力，但其影響卵巢癌遷移、侵襲能力的相關分子機制尚不清楚。

EMT是惡性腫瘤轉移的重要階段，其中上皮細胞失去細胞內黏附和細胞極性，并增強其運動性和侵入性，成為間充質細胞。EMT過程調節多種蛋白的表達，如增加間充質標志物vimentin的表達，減少上皮標志物E-cadherin的表達。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活已被指出參與多種腫瘤的發生[7]。該通路的激活促進了癌細胞中EMT的過程，為腫瘤提供了更強的生存和轉移能力[14]。β-catenin是Wnt信號通路中的關鍵蛋白。在Wnt信號存在和E-cadherin缺失的情況下，β-catenin在胞質中的積累，隨后是胞核中的易位和活化，并激活EMT促進因子的表達，癌細胞之間的黏附性降低，這是腫瘤轉移的關鍵[15-16]。Bokhari等[11]提出孕激素可抑制EMT從而影響子宮內膜癌的遷移及侵襲。因此，作者推測孕激素是否通過抑制Wnt信號通路來影響卵巢癌細胞的遷移及侵襲。本實驗中運用Western blot法檢測不同濃度孕激素作用于SKOV3、HO-8910細胞后β-catenin的表達情況。結果顯示，隨著孕激素濃度的增加，β-catenin蛋白表達逐漸降低，呈劑量依賴性。這提示孕激素可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來降低卵巢癌細胞的遷移、侵襲能力。

PGRMC2是新近來發現的一種小分子蛋白，屬于孕激素受體膜成分家族的成員[17]。有幾項研究結果指出，PGRMC2可能在腫瘤中發揮作用。在子宮頸腺癌的淋巴結轉移中，大量PGRMC2的丟失提示PGRMC2可能在子宮頸腺癌轉移中起腫瘤抑制因子的作用[17]。此外，Albrecht等[5]研究表明PGRMC2在SKOV3細胞中的升高導致較低的遷移率，而降低PGRMC2水平導致較高的遷移率。關于PGRMC2影響腫瘤轉移的機制有研究顯示[5]，G-actin單體和F-actin多聚體的比例與細胞的增殖和遷移相關，并且具有侵襲性的腫瘤細胞顯示出與肌動蛋白聚合相關的信號通路的改變。此外，有文獻顯示類固醇激素信號傳導可引起肌動蛋白細胞骨架的重組，這表明PGRMC2作為推定的孕酮受體可能通過肌動蛋白細胞骨架的重組介導細胞的遷移、侵襲作用。有研究發現在前列腺癌細胞中長期使用睪酮刺激可出現肌動蛋白的解聚。相反，細胞短時間暴露于睪酮會導致肌動蛋白聚合，這些作用是由睪酮膜受體介導的。但Albrecht等的研究中未檢測到肌動蛋白細胞骨架的重組參與PGRMC2的遷移調節作用，他們推測PGRMC2可能通過作用一系列的細胞黏附分子來影響細胞遷移?？傊?，PGRMC2影響遷移的機制仍不清楚，需要進一步深入探究。

本實驗選取兩株人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3、HO-8910細胞，運用不同濃度的孕激素作用于細胞并檢測其PGRMC2表達情況。據了解，不同分化程度的卵巢癌中是否存在PGRMC2表達變化，國內外未見相關文獻報道。本實驗首次探究了PGRMC2蛋白在卵巢癌SKOV3、HO-8910細胞中的表達情況。Western blot法顯示，PGRMC2在兩株癌細胞中均有表達，其中HO-8910細胞的PGRMC2蛋白相對表達量較SKOV3顯著升高。另外還發現，不同濃度孕激素處理后兩株細胞的PGRMC2蛋白表達不受影響。但β-catenin蛋白表達降低，且β-catenin蛋白在PGRMC2表達較高的HO-8910中調節得更明顯。由于細胞對孕激素的反應取決于孕酮受體，這提示在卵巢癌細胞中存在功能性孕酮受體。由于本實驗未采用siRNA技術沉默PGRMC2來觀察Wnt/β-catenin相應蛋白有無變化，因為無法確切說明Wnt/β-catenin信號通路組分的改變是由PGRMC2特異性介導的。

綜上所述，本實驗發現，相對于PGRMC2表達較低的SKOV3細胞來說，孕激素抑制PGRMC2表達較高的HO-8910細胞的增殖、遷移及侵襲能力更強。這種作用可能由PGRMC2介導，通過調節Wnt通路引起EMT相關蛋白E-cadherin、β-catenin的改變從而影響卵巢癌細胞的轉移。然而，卵巢癌細胞中存在多種信號通路的異?；罨渲邪≒I3K/Akt、TGF-β/SMAD等通路。有研究表明[13]，孕激素通過調節PIK3/AKT信號通路增加腫瘤抑制基因nm23-H1的表達從而抑制細胞遷移和侵襲?？梢娐殉舶┺D移的機制并非是單個通路發揮作用，其可能是多個通路相互影響。另外，孕激素各個類型的受體(PGRMC1、PGRMC2、PR/A、PR/B)之間的相互作用仍不清楚。因此需進一步開展實驗來了解各個通路之間的相互作用。