環狀RNA-circEPSTI1在子宮頸癌生長與侵襲中的作用及機制

彭 芳，丁向東，周揚帆，王貴明，陳艷宇

子宮頸癌是女性第三大常見惡性腫瘤，占所有癌癥的12%。每年有超過20萬女性死于子宮頸癌[1]。在中國，子宮頸癌的發病率約為其他發達國家的6倍，且每年約有13萬人死于子宮頸癌[2]。因此，鑒定新的有效預后生物標志物是子宮頸癌研究的重要目標。

環狀RNA(circRNAs)是內源性非編碼RNA的一類，其結構為共價環狀閉合的單鏈RNA。越來越多的證據表明，circRNA與多種人類疾病相關，如動脈粥樣硬化[3]、阿爾茨海默病[4]、糖尿病[5]，尤其是腫瘤[6]。大量研究表明，circRNAs在腫瘤進展中起著至關重要的作用，在食管癌中，circ0043898作為腫瘤抑制因子可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，并能誘導癌細胞凋亡和死亡[7]。在非小細胞肺癌中，circRNAF-circEA-2a作為腫瘤促進因子可促進癌細胞的遷移和侵襲[8]。但大多數circRNAs在子宮頸癌中的功能仍然未知。采用qRT-PCR技術檢測子宮頸癌細胞系及組織、正常子宮頸上皮細胞及正常子宮頸組織中circEPSTI1的表達，探討circRNA-circEPSTI1在子宮頸癌生長與侵襲中的作用及機制，以期為子宮頸癌的治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 標本收集2016年4月～2018年9月廣東省第二人民醫院手術切除的新鮮子宮頸癌組織92例。患者年齡范圍31～65歲，中位年齡51.4歲，≤50歲者42例，>50歲者50例；腫瘤組織≤4 cm者38例，>4 cm者54例；FIGO分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；組織學分級：Ⅰ期30例，Ⅱ期37例，Ⅲ期25例；病理類型：鱗癌64例，腺癌28例；有淋巴結轉移者69例，無淋巴結轉移者23例；HPV陽性59例，HPV陰性33例。60例正常子宮頸組織來源于本院同期因子宮良性病變行全子宮切除術患者，年齡范圍32～58歲，中位年齡50.2歲。標本置DEPC水處理后的EP管中，液氮里速凍30 min后轉入-80 ℃冰箱保存備用。本實驗獲廣東省第二人民醫院衛生委員會倫理委員會批準收集和使用標本組織。

1.2 細胞及組織SiHa和HeLa人子宮頸癌細胞株以及End1/E6E7人正常子宮頸上皮細胞株購于中國科學院細胞庫，用10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，置37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 采用qRT-PCR技術檢測circEPSTI1的表達。用RNA抽提試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen公司)分別抽提三種細胞株中的總RNA，再經逆轉錄試劑盒(Biorad公司)合成cDNA于-70 ℃儲存備用。冷凍保存的子宮頸癌及正常子宮頸組織標本放入研缽中，加入少量液氮充分研磨標本呈粉末，于研缽中加入0.6 mL Trizol，繼續研磨標本成勻漿后，加入Tube管中，采用Trizol法抽提組織中的總RNA，再經逆轉錄試劑盒合成cDNA存于-70 ℃。具體操作方法依據文獻[9]。PCR擴增反應體系包括2x QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix 10 μL，10x miScript Universal Primer 2 μL，10x miScript Primer Assay 2 μL，Template cDNA 1 μg，RNase-free water加至共20 μL。循環體系為：Cycle 1：37 ℃ 15 min，3個循環；Cycle 2：94 ℃ 5 s，55 ℃ 5 s，70 ℃ 5 s，合計40個循環；Cycle 3：4 ℃ 5 s，在CFX96 qRT-PCR系統上檢測。以β-actin為內參，所測定的circEPSTI1相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。

1.3.2細胞轉染與鑒定 si-circEPSTI1、si-NC質粒以及Lipofectamine 2000均購于美國Invitrogen公司，CCK-8粉購于美國Sigma公司。常規培養SiHa和HeLa細胞至90%匯合度后收集細胞，制成每毫升1×105個細胞的懸液，按每孔2 mL鋪至6孔板內，放置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，待細胞匯合度達50%時用于細胞轉染。將si-circEPSTI1與si-NC轉染質粒按轉染說明分別轉染于SiHa和HeLa細胞中。置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養48 h后收集細胞。細胞分為si-circEPSTI1組與si-NC組，其中si-NC組為si-circEPSTI1組的對照組，采用qRT-PCR驗證轉染效率。

1.3.3CCK-8 分別取上述兩組轉染后的SiHa和HeLa細胞懸液100 μL(約1×103細胞)接種到96孔板中，設復孔6個；細胞接種后培養，在監測點時(第1、2、3、4、5天)，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養板混勻，避免氣泡產生影響OD值的讀數；37 ℃孵育2 h，使用Bio-Tek EPOCH2測量450 nm的OD值；重復實驗3次。

1.3.4裸鼠皮下成瘤實驗 4周齡雌性BALB/c裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，6只，質量(20±2) g。隨機分為si-circEPSTI1組和si-NC組，每組3只。取HeLa細胞懸液1 mL(約5×107細胞)接種于裸鼠一側腋部皮下，每組3只裸鼠；記錄觀察裸鼠的一般情況、移植瘤形成的時間及大??；si-circEPSTI1組以40 μL si-circEPSTI1進行瘤內原位多點注射，si-NC組以40 μL si-NC進行瘤內原位多點注射，每4天1次；實驗結束后，將腫瘤完整剝離并進行大體照相，測量腫瘤體積及重量。所有動物實驗部分遵循標準動物護理和實驗室指南并獲得廣東省第二人民醫院倫理批準。

1.3.5Transwell侵襲實驗 在Transwell小室(美國Invitrogen公司)中鋪加8 μL稀釋好的基質膠，過夜形成基質膜。在Transwell小室上層分別接種轉染si-circEPSTI1或si-NC轉染質粒的SiHa或HeLa細胞懸液，細胞懸液濃度為每毫升1×105個細胞，接種量100 μL。下腔加500 μL含20%FBS的培養液。置37 ℃溫箱中孵育36 h，取出，用棉簽擦棄小室上層未遷移的細胞，PBS液輕洗，4%多聚甲醛固定、結晶祡染色下層穿出細胞，PBS液洗，倒置，晾干。光鏡下觀察拍照，隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值，實驗重復3次。

1.3.6Western blot法 采用Western blot法檢測circEPSTI1對EPSTI1、Twist、Slug蛋白的表達。HeLa細胞轉染后繼續培養48 h，收獲細胞。RIPA裂解細胞并提取細胞總蛋白，用BCA法測定細胞的蛋白濃度，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉膜，封閉1 h，加入EPSTI1、Twist、Slug抗體或β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發光，X片曝光、顯影、定影，掃描圖片，并計算結果。

2 結果

2.1 人子宮頸癌細胞及組織中circEPSTI1的表達qRT-PCR檢測結果顯示，人子宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞中circEPSTI1的表達水平分別為1.726±0.046、1.589±0.039，與正常子宮頸上皮細胞株End1/E6E7細胞的表達水平(0.638±0.058)相比，差異有統計學意義(P<0.01)(圖1A)。子宮頸癌組織中circEPSTI1的表達水平為1.718±0.036，與正常子宮頸組織中的表達水平(0.613±0.023)相比，差異有統計學意義(P<0.01)(圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測circEPSTI1在人子宮頸癌SiHa細胞、HeLa細胞、正常子宮頸上皮細胞End1/E6E7和子宮頸癌組織、正常子宮頸組織中的表達

與正常子宮頸上皮細胞和正常子宮頸組織相比，**P<0.01

2.2 子宮頸癌組織中circEPSTI1的表達與臨床病理特征的關系circEPSTI1的表達水平與FIGO分期、組織學分級和淋巴結轉移有關，在FIGO分期為I期的患者中的表達明顯低于FIGO分期為Ⅱ～Ⅲ期的患者，差異有統計學意義(P=0.025)；在組織學分級為I期的患者中circEPSTI1的表達明顯低于組織學分級為Ⅱ+Ⅲ期的患者，差異有統計學意義(P=0.002)；在有淋巴結轉移的組織中circEPSTI1的表達明顯高于無淋巴結轉移的組織，差異有統計學意義(P=0.038)；circEPSTI1的表達與患者年齡(50歲分界)、腫瘤大小、病理類型、HPV感染無關(P>0.05，表1)。

2.3 敲減circRNA-circEPSTI1對子宮頸癌細胞生物學性狀的影響為進一步評估circEPSTI1在子宮頸癌細胞中所發揮的生物學功能，通過轉染si-circEPSTI1的方式敲減子宮頸癌細胞系(SiHa和HeLa細胞)中circEPSTI1的表達。qRT-PCR實驗發現，在轉染si-circEPSTI1后，子宮頸癌細胞系(SiHa和HeLa細胞)中circEPSTI1的表達水平均顯著下調(P<0.01)(圖2)。

表1 子宮頸癌中circEPSTI1的表達與臨床病理特征的關系

*P<0.05

圖2 qRT-PCR檢測轉染si-circEPSTI1后SiHa和HeLa細胞中circEPSTI1的表達與si-NC組相比，**P<0.01

為探討circEPSTI1在體外對子宮頸癌細胞的增殖作用，采用CCK-8細胞增殖實驗進行檢測，結果顯示，在子宮頸癌細胞系(SiHa和HeLa細胞)中，與si-NC組相比，si-circEPSTI1組細胞在450 nm處的OD值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)(圖3)。提示通過抑制circEPSTI1的表達水平，能夠顯著抑制子宮頸癌細胞系的增殖。

圖3 CCK-8法檢測si-circEPSTI1對SiHa(A)和HeLa(B)細胞增殖能力的影響與si-NC組相比，**P<0.01

為了探討circEPSTI1在體內對子宮頸癌細胞的生長作用，進行了裸鼠成瘤實驗。在皮下注射裸鼠成瘤實驗中，通過連續28天的觀察發現，si-circEPSTI1組的裸鼠腫瘤質量明顯低于si-NC組(P<0.05)(圖4)。此結果表明，敲低circEPSTI1表達水平，在體內能夠顯著抑制子宮頸癌細胞的生長。

為進一步檢測circEPSTI1在體外對子宮頸癌細胞侵襲能力的影響，采用Transwell侵襲實驗檢測，結果顯示在子宮頸癌細胞系(SiHa和HeLa細胞)中，與si-NC組相比，si-circEPSTI1組的子宮頸癌細胞穿過基質膜的數目明顯減少(P<0.01)(圖5)。提示敲低circEPSTI1表達水平，能夠抑制子宮頸癌細胞的侵襲能力。

2.4 Western blot法檢測si-circEPSTI1對EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達的影響Western blot法檢測結果顯示，在子宮頸癌HeLa細胞中，si-circEPSTI1組EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達水平明顯低于si-NC組(圖6)，差異有統計學意義(P<0.01)。提示敲低circEPSTI1表達水平能顯著抑制EPSTI1、Twist、Slug的表達。

圖4 裸鼠移植瘤實驗檢測si-circEPSTI1對腫瘤生長的影響與si-NC組相比，*P<0.05

圖5 Transwell侵襲實驗檢測si-circEPSTI1對SiHa和HeLa細胞侵襲能力的影響

圖6 Western blot法檢測si-circEPSTI1對EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達的影響

3 討論

circRNA具有豐富的跨物種保守特征，在唾液、血液和外泌體中穩定表達，且具有組織/發育階段特異性，滿足有希望的癌癥生物標志物的要求。此外，因circRNA數量相對較少，故比miRNA更容易被檢測到。越來越多的研究報道，circRNAs參與腫瘤的進展。在胃癌中circ_002059表達下調，并與遠處轉移、TNM分期相關[10]。circ_100855在喉鱗狀細胞癌組織中顯著上調和circ_104912顯著下調，并且兩者的表達與腫瘤分期和頸部淋巴結轉移顯著相關，提示circ_100855與circ_104912是喉鱗狀細胞癌潛在的新的生物標志物[11]。Yao等[12]發現非小細胞肺癌中circRNA_100876上調，且其上調與淋巴結轉移、腫瘤分期及預后密切相關，提示circRNA_100876可能作為非小細胞肺癌預后判斷的分子標志物和治療新靶點。circBRAF在高級別(Ⅲ和Ⅳ)膠質瘤中的表達顯著低于低級別(I和II)，circBRAF可能是膠質瘤患者病理分級和預后的預測生物標志物[13]。circRNA_000479來自于EPSTI1基因，位于染色體13q14上，因此將circRNA_000479命名為“circEPSTI1”。研究發現circEPSTI1在骨肉瘤、卵巢癌及三陰型乳腺癌中的表達均增高[9,14-15]，circEPSTI1的表達增高與三陰型乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結轉移以及TNM分期呈正相關，并且亦與患者總生存期和無瘤生存期相關[9]。目前，只有少數報道有關子宮頸癌circRNAs的研究。本實驗發現circEPSTI1在子宮頸癌細胞與組織中高表達，并且circEPSTI1的表達水平與FIGO分期、腫瘤分級以及淋巴結轉移明顯相關，與上述研究相符。提示circEPSTI1在子宮頸癌的發生、發展過程中可能發揮重要的功能。

研究報道，circRNA以miRNA海綿或競爭性內源性RNAs(ceRNAs)的形式調節基因表達。研究顯示，不同的circRNA在腫瘤中功能各異。有些充當腫瘤抑制因子，而有些充當腫瘤促進因子樣作用。如在非小細胞肺癌中，hsa_circ_0033155可作為腫瘤抑制因子調節細胞增殖、集落形成和遷移[16]。在膀胱癌中，過表達circTCF25通過circTCF25-miR-103a-3p/CDK6途徑促進腫瘤細胞增殖和遷移[17]。在三陰型乳腺癌中，circEPSTI1通過吸附miR-4753和miR-6809調節BCL11A表達，從而影響細胞的增殖和凋亡[9]。在骨肉瘤中，circEPSTI1通過miR-892b-MCL1軸調節腫瘤細胞的增殖與遷移[14]。本實驗結果顯示，在子宮頸癌細胞中減少circEPSTI1表達，抑制體外培養癌細胞的增殖和侵襲，同時抑制異種移植瘤的生長，提示circEPSTI1可能促進子宮頸癌的進展。EPSTI1是定位于13q13.3染色體的干擾素應答基因，研究發現EPSTI1在浸潤性乳腺癌中高度表達并參與乳腺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡[18]。研究還發現，EPSTI1可以調節腫瘤細胞的上皮-間質轉化[19]。EPSTI1的表達對上皮-間質轉化有促進作用[18]。因此，EPSTI1是一個重要的上皮-間質轉化調節因子。本實驗在敲減circEPSTI1表達后，發現子宮頸癌細胞中的EPSTI1、Twist、Slug蛋白表達水平均明顯下調，提示circEPSTI1促進子宮頸癌中細胞的生長與侵襲可能是通過調控EPSTI1、Twist、Slug信號通路而實現的。

綜上所述，circEPSTI1在子宮頸癌細胞系與組織中高表達并與子宮頸癌的高級別FIGO分期、高組織學以及淋巴結轉移密切相關。敲減circEPSTI1表達，能夠抑制子宮頸癌細胞生長與侵襲，其機制可能與調控EPSTI1、Twist、Slug信號通路有關。因此，circEPSTI1可能有望成為子宮頸癌潛在的生物標志物和治療靶點。