鹽酸脫鈣液后脫鈣在骨髓組織活檢中的應用及體會

施棟梁，胡曉梅，鄭宇輝，邱小文，黃建平，楊映紅

骨髓組織活檢是明確骨髓病變最主要的方法之一，但由于骨髓組織中含有大量的磷酸鈣和碳酸鈣，在常規制片中易致切片破碎、刀痕嚴重等問題，因此對骨髓組織進行充分的脫鈣也顯得格外重要[1-2]。目前在臨床工作中，我們常使用的脫鈣液有酸類脫鈣液、電解質脫鈣液、螯合劑脫鈣液、離子交換樹脂脫鈣液等[2-3]。這些脫鈣液作用機制不同，效果各有千秋[4]。在實際臨床工作中我們對脫鈣液選擇的標準應該是效果強、時間短、對組織細胞形態以及對抗原影響小等[5]。本實驗室根據多年的工作經驗，采用2%鹽酸脫鈣液應用于骨髓組織活檢中，并取得了良好的效果，現將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集福建醫科大學附屬協和醫院病理科2018年1月～2019年3月使用2%鹽酸脫鈣液脫鈣的骨髓組織活檢標本500例。標本類型為骨髓穿刺活檢組織，標本直徑0.2 cm，長度>1.0 cm。

1.2 實驗儀器及試劑全自動染色儀HE600購自美國Ventana公司；TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda購自福州邁新公司；PAX5購自美國羅氏公司；二抗、檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)、DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司；濃鹽酸溶液(鹽酸含量36%～38%)購自上海試一化學公司。

1.3 方法

1.3.12%鹽酸脫鈣液配制 取5.4 mL濃鹽酸(鹽酸濃度36%～38%)和94.6 mL蒸餾水，制成濃度為2%鹽酸脫鈣液。

1.3.2脫鈣方法(后脫鈣法) 新鮮的骨髓穿刺組織經取材后及時用10%中性福爾馬林固定4～6 h；在全自動脫水機中脫水、浸蠟；包埋時將骨髓組織沿包埋框的對角線放置，待冷卻后制成蠟塊；蠟塊修整時充分暴露骨髓組織最大面，隨后將最大組織面浸泡于2%鹽酸脫鈣液中，使得鹽酸脫鈣液充分與骨髓組織表面接觸；每5～10 min用大頭針探測骨髓組織表面，當大頭針能輕易刺入組織時提示脫鈣完成，若刺入時有阻力則需繼續脫鈣。脫鈣后將骨髓活檢組織置于冰盤上，待進行常規切片。

1.3.3HE染色 常規組織切片后應用Ventana HE600進行骨髓HE染色。

1.3.4免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，70 ℃烤片60 min，二甲苯脫蠟20 min至無水乙醇溶液，水洗，檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)高壓鍋修復2.5 min，3%過氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，分別滴加一抗，室溫孵育120 min，PBS沖洗，滴加增強劑孵育20 min，PBS沖洗后滴加二抗，孵育30 min，PBS沖洗，DAB室溫顯色3～5 min，自來水沖洗終止顯色，蘇木精復染，氨水返藍，脫水、透明、封固。

1.3.5抗體選擇及結果判定 選取在急性淋巴細胞白血病、淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤診斷中常用的抗體。PAX5(MX017)、TdT(SEN28)是細胞核抗原，CD20(L26)、CD56(MX039)是細胞膜抗原，Kappa(多克隆)、Lambda(LAM03+HP6054)是細胞質抗原。切片按照染色陽性強度分別進行評估，分為強陽性()、中等陽性()、弱陽性(+)和陰性(-)。其中陰性和弱陽性為低表達，中等陽性和強陽性為高表達。

2 結果

2.1 脫鈣時間及制片效果骨髓組織經2%鹽酸脫鈣液處理后，平均脫鈣時間為(65±15) min，脫鈣時間較短。應用該方法制片效果良好，制片時易切出完整的切片，且對刀片的損傷小(圖1)。

2.2 HE染色骨髓組織經2%鹽酸脫鈣液處理后，HE染色顯示骨髓組織形態完整，結構清晰，細胞核和細胞質層次分明，透明度好(圖2)。按照HE制片質控評價指標進行評價，HE染色平均得分為91分(>90分為優質的玻片標本)。

2.3 免疫組化染色PAX5、TdT陽性定位于細胞核，CD20、CD56陽性定位于細胞膜，Kappa、Lambda定位于細胞質。PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在組織中表達良好，陽性定位準確，背景清晰(圖3)。

圖1 應用2%鹽酸脫鈣液脫鈣后骨髓組織制片效果

圖2 骨髓組織HE染色，結構清晰，透明度好

圖3骨髓免疫組化染色：A.TdT；B.CD20；C.CD56；D.Kappa，EnVision兩步法

3 討論

骨髓組織中含有大量的磷酸鈣和碳酸鈣，在常規石蠟切片中容易造成切片破碎、刀痕嚴重等問題，因此充分的脫鈣是制成優質HE切片的前提[1]。在實際工作中脫鈣時間的掌握是制片成功與否的關鍵。脫鈣時間太短時切片破碎、刀痕嚴重；脫鈣時間過長時HE染色不佳、免疫組化染色易出現假陰性[3]。目前常用的脫鈣方法中，電解質脫鈣法實驗過程繁瑣，需要安裝特殊設備；螯合劑脫鈣法對組織破壞小，但脫鈣作用異常緩慢；酸類脫鈣法脫鈣時間短，操作簡易，是臨床工作中最常用的脫鈣方法[2,6]，因此在本實驗中選用酸類脫鈣液。

大部分實驗室采用的是“前脫鈣法”，也就是骨髓組織在脫水、石蠟包埋前浸泡在各類的脫鈣液中進行脫鈣，等脫鈣完成后再進行脫水、石蠟包埋[7]。本實驗采用的是“后脫鈣法”，即骨髓組織經固定、取材、脫水、石蠟包埋后進行蠟塊修整，充分暴露最大組織面后浸泡于2%鹽酸脫鈣液中，待脫鈣完成后進行制片。應用該方法進行脫鈣后，脫鈣時間明顯縮短，若個別標本在制片時仍有切片破碎時，只需再浸泡1～2 min即可順利完成制片，且制片效果優良。在HE染色中，骨髓組織形態完整，結構清晰，細胞核和細胞質層次分明，透明度好，達到優質HE染色片的要求。

有文獻報道酸性脫鈣液對骨髓組織抗原有一定的破壞性，長時間的酸處理容易造成抗原破壞，使得免疫組化染色出現假陰性，進而影響診斷[6,8]。在骨髓組織中，抗原表達情況對骨髓疾病診斷至關重要，因此脫鈣液的選擇應該滿足對抗原影響小這一必要條件[1]。為了探討2%鹽酸脫鈣液對骨髓組織抗原表達情況的影響，本實驗選取了臨床實際工作中常用的抗體，分別定位于細胞核(PAX5、TdT)、細胞質(CD20、CD56)、細胞膜(Kappa、Lambda)。經2%鹽酸脫鈣液處理后，PAX5、TdT、CD20、CD56、Kappa、Lambda在組織中表達良好，陽性定位準確，背景清晰。這一結果提示低濃度、短時間的脫鈣處理，對骨髓組織抗原完整性影響小，從而避免了免疫組化假陰性的產生。

總之，在骨髓組織活檢中，通過2%鹽酸脫鈣液后脫鈣的處理方法，不僅能夠制出優良的HE切片，而且低濃度、短時間的酸處理能夠最大限度的保護抗原，避免了免疫組化中假陰性的產生。該方法值得在各個實驗室中推廣使用。