殼聚糖復合止血海綿的制備及其在硅膠球囊中的應用

湯瑞明 耿在云 宋亮 王超

【摘 要】當前，越來越多的女性推遲了結婚與生育，大齡產婦明顯增多，產后出血已成為婦女生育后常見的一種現象。宮腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的嚴重產后出血，因此研究開發新型宮內止血球囊器械具有重要意義。為進一步提高止血球囊的止血效果，文章就研究開發的硅膠止血球囊表面包覆殼聚糖止血海綿的止血性質進行一系列探討，具體包括止血海綿的制備、微觀結構分析、吸水率測定、凝血性能測定、細胞毒性測試等，研究結果表明，文章制備的殼聚糖/海藻酸鹽復合止血海綿具有良好的止血效果，可用于新型止血球囊表面包覆。

【關鍵詞】殼聚糖;海藻酸鹽;白芨;海綿;止血

0 引言

隨著我國全面二孩政策的實施，大齡產婦明顯增多，產后出血已成為婦女生育后常見的一種現象[1]。目前，如何降低產后出血量，已經成為廣大醫生與醫療器械生產制造企業不懈的共同追求目標。治療產后出血的方法包括藥物保守治療、盆腔血管結扎法、改良式B-Lynch子宮背帶式縫合、血管性介入治療和物理子宮填塞壓迫止血等[2-3]。其中，宮腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的嚴重產后出血[4-5]。由于該止血方法具有操作簡單、對孕產婦危害小、費用低、安全快速、術后康復快等優點，因此研究開發新型宮內止血球囊器械具有重要意義。為進一步提高止血球囊的止血效果，本文就江蘇瑞京科技發展有限公司研究開發的硅膠止血球囊表面包覆殼聚糖止血海綿的止血性質進行一系列探討，為開發具有更好的止血球囊創造條件。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料試劑

殼聚糖（簡稱CS），中等黏度，購自阿拉丁試劑公司;海藻酸鈣（簡稱Alg-Ca）：自己制作多孔微球;白芨多糖（簡稱BSP）：實驗室自己提取;戊巴比妥鈉（P3790），購自SECOMA公司;戊二醛25%，購自科密歐化學試劑公司;胎牛血清，Procell公司;DMEM培養液，購自Procell公司;小鼠胚胎成纖維細胞3T3，購自Procell公司。

1.1.2 主要儀器

冷凍干燥機，型號為LGJ-10C，由四環科學儀器公司制造;冷凍離心機，由日本日立公司制造;S-4800型掃描電子顯微鏡，由日本日立公司制造;生物數碼顯微鏡，型號為MC-1180，由蔚儀金相試驗儀器公司制造;iMark酶標儀，由Bio-RAD公司制造。

1.2 復合海綿的制備

稱取一定量殼聚糖加到100 mL 1%醋酸溶液中，靜置脫泡，獲得殼聚糖醋酸溶液。

稱取一定量海藻酸鈣，按5%、10%、15%、20%的質量分數，加入到以上的殼聚糖溶液中，攪拌均勻，即得到CS/Alg-Ca混合溶液。

稱取一定量白芨多糖，按2.5%、5%、7.5%、10%質量分數，加入到以上的上述殼聚糖/海藻酸鈣溶液中，攪拌均勻，即得到CS/Alg-Ca/Bsp溶液。

CS/Alg-Ca復合海綿制備：準確稱取一定量殼聚糖溶液，加入5%、10%、15%、20%的Alg-Ca海藻酸鈣微球，于-70 ℃溫度下冷凍干燥，得到CS/Alg-Ca復合海綿。

1.3 微觀結構分析

按照掃描電子顯微鏡的制樣方法制作樣品，然后在合適的放大倍數下觀察樣品微觀結構。

1.4 復合海綿吸水率測定

將復合海綿裁成長方條，干燥至恒重，稱重標記為W0。樣條放入含生理鹽水燒杯中，浸泡3 min，瀝水1 min，吸掉表面的水分，稱重標記為Wt。吸水率按如下公式計算：吸水率=Wt-W0/W0×100%

1.5 復合海綿的凝血測試

根據Shih MF方法，用全血凝血指數BCI進行評根據Shih MF方法，用全血凝血指數BCI進行評價。用紫外分光光度計在波長545 nm處測其吸光度。BCI計算方法如下：

BCI=A樣品/A空白×100%

1.6 復合海綿對凝血酶原時間（PT）的影響

取各種復合海綿與殼聚糖海綿，在紫外燈下滅菌，然后測定PT。

在37 ℃恒溫水浴中，待測樣品孵育3 min，加入0.1 mL血漿，吸收后，加入0.2 mL的37 ℃預溫PT試劑，開始計時，到出現絲狀物即停止計時，記錄成絲時間，即為PT。

1.7 溶血率測定

材料的溶血率根據GB/T 14233.2—2005的要求進行測試。計算公式如下：

溶血率=（B樣品-B陰性）/（B陽性-B陰性）×100%

1.8 細胞毒性的測定

采用CCK-8法，測試復合海綿對3T3細胞的細胞毒性。根據GB/T 16886.5—2003的規定，計算細胞相對增殖率（RGR）：

RGR=OD（實驗組）/OD（對照組）×100%

1.9 動物止血評價

本文采用動脈血管為出血模型。將大鼠剝離出股動脈，施以準備好的待測樣品，開始計時，直至完全止血，記錄止血時間，然后稱量止血后的紗布和材料的總重后計算出血量。

2 結果與討論

2.1 殼聚糖海綿的微觀結構分析

圖1為殼聚糖和CS/Alg-Ca復合海綿的SEM和生物顯微鏡圖。A1～E1為SEM圖，A2～E2為放大40倍觀察到的圖。

其中，A1、A2為純殼聚糖;B1、B2為CS/Alg-Ca5;C1、C2為CS/Alg-Ca10;D1、D2為CS/Alg-Ca15;E1、E2為CS/Alg-Ca20;F為純殼聚糖;G為復合海綿。

從圖1可以看到，所得海綿具有蜂窩狀的多孔結構且相互連通，主要結構顯示為片狀結構，如果加入多孔微球，海綿結構沒有受到太大影響，微球主要黏附在片層上。隨著微球量的增加，位于海綿表面和內部的微球數量也增多，出現了團聚現象。這是因為殼聚糖是帶正電性的多糖，微球則帶負電荷，通過電荷作用，導致微球出現團聚，從而影響分散。

2.2 殼聚糖海綿的吸水率變化

圖2為復合海綿吸水率隨著Alg-Ca微球含量變化產生的曲線。曲線顯示，隨著微球含量的增加，海綿材料的吸水率出現先增加后減小的趨向。這是因為加入微球起到了分子篩的效果，提高了整體吸水性;同時，微球也增加了海綿中親水成分。數據顯示，海藻酸鈣含量為10%的復合海綿最大吸水率可以達到4 295.06%。

2.3 殼聚糖海綿的體外凝血分析

從圖3可以看出，制備的殼聚糖/海藻酸鈣復合海綿的凝血指數較小，并且逐漸隨著微球含量增加而減小。純殼聚糖的凝血指數是63.15%，CS/Alg-Ca5的凝血指數是47.80%，CS/Alg-Ca10的凝血指數是42.05%，CS/Alg-Ca15的凝血指數是33.09%，CS/Alg-Ca20的凝血指數是30.39%。CS/Alg-Ca/Bsp10的凝血指數最小為22.41%。分析認為，微球可以不斷放出鈣離子，能夠激活凝血因子。白芨多糖能夠有效縮短凝血酶原時間，促進血小板的凝集。所以，三元復合海綿的凝血效果比二元復合海綿的凝血效果更好。

2.4 組成不同的海綿對PT的影響

表1為不同組成比例對PT的影響效果，純殼聚糖差別不大，表明殼聚糖凝血不同于海藻酸鈣凝血。由于海藻酸鈣微球釋放出的Ca2+作用的結果，CS/Alg-Ca10復合海綿對PT影響較小，而含白芨多糖的三元海綿對PT影響顯著，并且隨多糖量的增加，PT值呈現較少趨勢。因此可以證明，CS/Alg-Ca/Bsp三元復合海綿可以有效提高凝血速率。

2.5 殼聚糖海綿的溶血率

表2為檢測材料與新鮮抗凝血作用后紅細胞釋放的血紅蛋白量。除了純殼聚糖，其他所有的復合海綿的溶血率均能夠達到標準要求的溶血率小于5%的數值，符合醫療器械中生物材料對溶血的要求。

2.6 海綿材料細胞毒性測試結果

采用CCK-8方法測試的復合海綿對小鼠胚胎成纖維細胞3T3的相對增殖率如圖4所示，可以看出，各組成比例下，細胞相對增殖率都超過90%，之間無明顯差異。加入白芨多糖，細胞相對增殖率則都超過100%，表明海綿材料的細胞毒性為零級，均有利于細胞的生長，對創傷的愈合起到促進作用。

2.7 殼聚糖海綿的動物出血模型止血效果

圖5為SD鼠股動脈出血模型，表3為不同復合海綿的止血測試結果，數據顯示，三元復合海綿的止血效果最好，其次是二元復合海綿，最后是純殼聚糖與明膠制作海綿。更進一步看出，白芨含量為10%的三元復合海綿的止血效果最佳，出血量最少，其與純殼聚糖相比，止血效率提升了47.3%，與CS/Alg-Ca10海綿相比，也提升了39.3%，比明膠海綿也提升了41.7%。這充分表明，殼聚糖、海藻酸鈣微球和白芨多糖產生了協同作用，能夠更有效止血。

2.8 止血機理分析

殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，在生物醫用敷料、藥物載體等領域獲得較多應用。從他人文獻可以看到，殼聚糖的分子結構中的第二個碳上帶有氨基，在酸性條件可以接受一個質子，成為帶正電荷的銨離子，而紅細胞是帶負電荷的，通過電荷作用，能夠使紅細胞聚集在創口，可以激活凝血系統，從而實現止血[6-9]。海藻酸鹽最大可吸收自身重量的20倍水分，海藻酸鈣多孔微球則是通過放出其所含的鈣離子，與凝血系統分數作用，刺激形成纖維蛋白原，從而吸附紅細胞，達到止血效果[10-12]。白芨多糖是依靠其能夠促進血小板凝集，并且縮短凝血酶原時間，從而達到凝血作用。因此，本文通過將海藻酸鈣多孔微球、白芨多糖、殼聚糖復合，獲得一種新型的海綿材料，通過提高材料吸水性能，同時提升了材料的止血性能，可作為新型止血材料應用于生物醫學領域。

3 結論

通過對復合海綿的理化性能、生物學性能和止血性能進行評價，得出如下結論。

（1）復合海綿中摻入白芨多糖，能夠有效縮短凝血酶原時間，提高止血速度，容易實現快速地止血。

（2）凝血指數BCI值結果表明，微球含量和白芨多糖含量高的復合海綿的凝血效果較佳，動物止血實驗表明，白芨多糖含量越高，復合海綿止血時間越短，出血量越少。

（3）通過溶血率、全身急性毒性實驗等分析，本研究制備的三元復合海綿具有良好的生物相容性。

參 考 文 獻

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