加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)膜性腎病大鼠TGF-β1、VEGF和MMP-9表達(dá)的影響*

劉張紅 程錦國(guó) 陳玲玲 黃蔚霞# 項(xiàng)方家 張 良

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 浙江 溫州 325000

2 溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 浙江 溫州 325000

3 臺(tái)州市中醫(yī)院 浙江 臺(tái)州 318000

近年來(lái)，我國(guó)膜性腎病（MN）患病率不斷升高，2004年至2014年間MN發(fā)病率平均每年增加13%，并隨著PM2.5的增加而增加，PM2.5每增加10μg/m3,MN發(fā)病率增加14%[1]。特發(fā)性膜性腎病（IMN）是構(gòu)成中老年患者原發(fā)性腎病綜合癥的常見(jiàn)疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但主流的觀點(diǎn)認(rèn)為[2]，IMN中足細(xì)胞形態(tài)及功能的改變，是引起IMN大量蛋白尿的主要原因。目前，對(duì)于IMN的治療以控制蛋白尿?yàn)橹鳎珹CEI和ARB能夠減少膜性腎病患者尿蛋白漏出，是膜性腎病治療的常用藥，但其在臨床使用中存在局限性。由于中醫(yī)藥在治療IMN方面療效確切，毒副作用較小而有著巨大的優(yōu)勢(shì)[3-5]。加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯是經(jīng)我們長(zhǎng)期臨床應(yīng)用后總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，其減少IMN的患者尿蛋白的功效確切[6]。本研究以膜性腎病大鼠為對(duì)象，觀察加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠血漿白蛋白、24h尿蛋白、腎臟組織病理形體和對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響，進(jìn)一步對(duì)加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療IMN的作用機(jī)制加以闡述。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200±20g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠實(shí)驗(yàn)性喂養(yǎng)1周后測(cè)24h尿蛋白定量＜10mg/24h，隨機(jī)分成對(duì)照組（S組）、模型組(M組)、貝那普利組(L組)、低劑量中藥組(A組)、中劑量中藥組(B組)、高劑量中藥組(C組)，每組各10只。采用被動(dòng)型Heymann腎炎動(dòng)物模型[7]作為模型，S組大鼠尾靜脈注射一次性生理鹽水6ml/kg，其余各組大鼠按照6mg/kg的劑量，一次性尾靜脈注射Anti-Fx1A進(jìn)行造模，1周后大鼠24小時(shí)尿蛋白＞10mg/kg即認(rèn)定造模成功。

1.2 藥物與試劑：加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯（生黃芪、貓人參各30g，桃仁、山萸肉各10g，川牛膝、地龍、生地、赤芍、懷山藥各15g，當(dāng)歸、川芎各9g，制大黃、紅花、陳皮各6g，土茯苓20g）煎劑，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片炮制中心提供，濃度分別為1.76g/ml、3.52g/ml、7.04g/ml。抗近端小管刷狀緣抗原（Anti-Fx1A）購(gòu)于PROBETEX公司（批號(hào)：PTX-002S）；鹽酸貝那普利片購(gòu)于北京諾華制藥有限公司（規(guī)格：10mg/片；批號(hào)：X2342）；TGF-β1抗體、VEGF抗體、MMP-9抗體均購(gòu)于Santa公司（批號(hào)：sc-52893、sc-7269、sc-13520）；BDA顯色盒（批號(hào)：ZLI-9019）、超敏二步法免疫組化試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋公司（批號(hào)：PV-6001）。BX51光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；微量移液槍購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 給藥：大鼠造模成功后開(kāi)始給藥，灌胃每日早晚各1次，共4周。S和M組給0.9%氯化鈉溶液10ml/kg，L組給予貝那普利溶液1.67mg/kg[8]，A、B、C組分別給予17.6g/(kg·d)、35.2g/(kg·d)、70.4g/(kg·d)加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯水煎劑，劑量為60kg體質(zhì)量正常成人每日生藥劑量的5、10、20倍[9]。

1.4 標(biāo)本采集：給藥前和給藥后4周，使用清潔代謝籠收集大鼠24h尿液，記錄尿量，檢測(cè)24h尿蛋白定量；以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，3000r/min離心10min分離血清，檢測(cè)血漿白蛋白。摘取腎臟，剝除包膜，留取腎組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片。

1.5 觀察指標(biāo)：分述如下。

1.5.1 血尿指標(biāo)檢測(cè)：檢測(cè)大鼠基礎(chǔ)、給藥前、給藥后1周和4周24h尿蛋白定量及給藥后血漿白蛋白水平。

1.5.2 腎臟組織病理改變觀察及TGF-β1、VEGF、MMP-9表達(dá)檢測(cè)：各組腎組織常規(guī)PASM染色，光鏡下觀察腎小球的病理變化。免疫組化檢測(cè)TGF-β1、VEGF、MMP-9表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)非重疊視野，注意避開(kāi)邊緣，使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行平均累積光密度值（IOD），取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0分析，本研究計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿白蛋白檢測(cè)結(jié)果和24h尿蛋白定量結(jié)果比較：造模后，造模組大鼠較S組大鼠，各時(shí)間點(diǎn)的24h尿蛋白定量均明顯升高（P＜0.05）。給藥后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的4個(gè)給藥組比M組的24h尿蛋白定量均有明顯降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠24h蛋白尿和血漿白蛋白水平比較（±s）

表1 各組大鼠24h蛋白尿和血漿白蛋白水平比較（±s）

注：與S組比較，*P＜0.05；與M組比較，△P＜0.05。

分組S組M組L組A組B組C組例數(shù)10 10 10 10 10 10基礎(chǔ)24h蛋白尿（mg/24h）3.31±1.38 2.52±1.91 2.81±1.05 2.94±1.23 2.98±1.34 3.14±1.51給藥前24h蛋白尿（mg/24h）7.15±3.40 31.81±6.87*26.10±6.64*△29.79±7.80*△28.11±9.09*△26.91±8.76*△給藥后7天24h蛋白尿（mg/24h）8.01±3.96 84.29±11.31*52.47±10.41*△51.49±10.67*△50.55±9.22*△49.53±8.72*△給藥后28天24h蛋白尿（mg/24h）9.52±3.61 76.03±9.53*43.57±10.48*△40.61±9.73*△41.09±10.87*△41.52±7.69*△血漿白蛋白(g/L）37.36±2.37 36.58±2.26 36.81±2.60 37.79±2.46 37.08±2.12 37.40±2.86

2.2 各組大鼠腎臟組織PASM染色比較：對(duì)照組未見(jiàn)明顯異常，其余各造模組腎小球體積增大，基底膜輕度增厚，毛細(xì)血管壁僵硬，可見(jiàn)上皮下“釘突”形成；腎小管上皮細(xì)胞呈空泡變性，偶有刷狀緣脫落。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變（PASM染色，×400）

2.3 各組大鼠TGF-β1、VEGF、MMP-9表達(dá)的比較：與S組比較，其余5組大鼠腎組織TGF-β1、MMP-9和VEGF表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）。與M組比較，L組和A、B、C 3個(gè)組TGF-β1和VEGF表達(dá)均減低（P＜0.05）。與M組比較，L組和A、B、C 3個(gè)組MMP-9表達(dá)均增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1、VEGF、MMP-9表達(dá)水平的比較（IDO值）（±s）

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1、VEGF、MMP-9表達(dá)水平的比較（IDO值）（±s）

注：與S組比較，*P＜0.05；與M組比較，△P＜0.05。

分組S組M組L組A組B組C組MMP-9 0.011±0.004 0.057±0.012#0.096±0.007*△0.098±0.008*△0.094±0.008*△0.094±0.007*△例數(shù)10 10 10 10 10 10 TGF-β1 0.012±0.004 0.180±0.014*0.108±0.008*△0.103±0.010*△0.105±0.011*△0.108±0.010*△VEGF 0.012±0.003 0.166±0.011#0.101±0.012*△0.101±0.011*△0.103±0.013*△0.104±0.010*△

3 討論

IMN臨床表現(xiàn)以大量蛋白尿?yàn)橹鳎慵?xì)胞的損傷和脫落與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)，是腎小球硬化形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[10-11]。目前已證實(shí)細(xì)胞因子如TGF-β1、VEGF等均能夠引起足細(xì)胞的EMT，其中TGF-β1是最主要的致細(xì)胞EMT因素，對(duì)以足細(xì)胞損害為主的腎小球疾病發(fā)生進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[12-13]。IMN在病理上以腎小球基底膜（GBM）的形態(tài)改變和彌漫性增厚以及釘突形成為主，GBM的增厚形態(tài)改變除免疫復(fù)合物形成的影響外，還包括IV型膠原、纖維連接蛋白和硫酸類肝素蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的增多與聚積。MMP-9參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)運(yùn)，如果MMP-9表達(dá)異常，IV膠原合成和降解失衡，基底膜重塑障礙，會(huì)導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生[14]。

加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯以清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)的補(bǔ)陽(yáng)還五湯為基礎(chǔ)方。原方中重用黃芪補(bǔ)益元?dú)猓瑲馔鷦t血行，瘀去絡(luò)通，為君藥；當(dāng)歸活血通絡(luò)而不傷血，為臣藥；赤芍、川芎、桃仁、紅花協(xié)當(dāng)歸以活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)，力專善走，周行全身，以行藥力。在此基礎(chǔ)上，筆者根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)加土茯苓、貓人參以清熱解毒除濕，加生地、山萸肉、山藥以滋腎養(yǎng)陰；川牛膝、制大黃祛瘀活血；陳皮理氣燥濕，助行氣化瘀，并滋而不膩，共為佐藥。諸藥合用，共奏益氣行血化瘀，滋陰清熱除濕之功。

課題采用被動(dòng)型Heymann腎炎大鼠模型，給予高、中、低劑量的加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯或貝那普利干預(yù)，研究表明加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠在一定程度上減少膜性腎病大鼠蛋白漏出，減輕足細(xì)胞損傷及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯或貝那普利干預(yù)的膜性腎病大鼠血清白蛋白較模型組明顯升高，24h尿蛋白定量及TGF-β1、VEGF的表達(dá)較模型組均明顯減少，而MMP-9的表達(dá)增加；與貝那普利組比較，加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高3個(gè)劑量組血清白蛋白、24h尿蛋白定量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TGF-β1、VEGF、MMP-9的表達(dá)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明3個(gè)劑量組的加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)膜性腎病大鼠的治療作用與貝那普利相當(dāng)。由此筆者推測(cè)，加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)減少TGF-β1、VEGF的表達(dá)，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，減少足細(xì)胞損傷及EMT，減少減少尿蛋白的漏出，從而延緩腎臟疾病的進(jìn)展。

通過(guò)一系列研究，證實(shí)加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有較好的保護(hù)足細(xì)胞減少蛋白尿作用，加減補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用與貝那普利相當(dāng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1、VEGF的表達(dá)，上調(diào)MMP-9的表達(dá)有關(guān)，但更細(xì)致的分子作用機(jī)制尚需更深入的研究。