不明原因反復(fù)流產(chǎn)者T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)及其臨床意義

吳杰儒

(江西省婦幼保健院檢驗(yàn)科，南昌 330006)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指存在≥3次持續(xù)性自然流產(chǎn)現(xiàn)象，其病因與胚胎染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常等因素有關(guān)，但有40%～50%的患者流產(chǎn)原因不明確，稱為不明原因反復(fù)流產(chǎn)(URSA)[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，母體的妊娠免疫耐受失衡與URSA發(fā)生有關(guān)，而妊娠免疫耐受失衡常伴隨著T細(xì)胞的異常增殖活化和細(xì)胞因子的異常分泌。程序性細(xì)胞死亡分子-1(PD-1)作為重要的抑制性共刺激分子，通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化和增殖負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答。鑒于此，本研究探討URSA患者T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年5月至2019年5月江西省婦幼保健院收治的URSA患者20例(URSA組)，選擇同期行人工流產(chǎn)的正常健康早孕婦女20例作為對(duì)照組。URSA組，年齡22～35歲，平均(28.67±3.16)歲；孕周5～12周，平均(8.75±2.13)周。對(duì)照組，年齡21～35歲，平均(28.39±3.02)歲；孕周4～12周，平均(8.28±2.35)周。2組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可對(duì)比性。知情同意書均由患者及其家屬簽署，且經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

URSA患者既往無(wú)活產(chǎn)史，自身抗體陰性；對(duì)照組有活產(chǎn)史，無(wú)自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)史，孕期無(wú)腹痛及陰道出血，B超提示胚胎發(fā)育正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神障礙者；嚴(yán)重器官功能異常者；有染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常等。

1.3 檢測(cè)方法

經(jīng)患者知情同意后，采集研究對(duì)象的部分蛻膜組織和外周血，以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡漂洗蛻膜，2 h內(nèi)分離單個(gè)核細(xì)胞，重懸后備用。分離外周血和蛻膜組織中單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞中CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)檢測(cè)：取5 μL的CD3-FITC及PD-1-PE加入100 μL PBMCs懸液，設(shè)立同型對(duì)照，室溫15 min避光孵育；加2 mL Buffer洗滌，10 min、300×g離心，棄上清液；加Buffer重懸細(xì)胞500 μL，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：CyAN-ADP)檢測(cè)CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果用百分比(%)表示。血漿中細(xì)胞因子含量檢測(cè)：依據(jù)試劑盒操作步驟流程，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)外周血白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

記錄外周血及脫膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá);比較外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)由SPSS18.0軟件處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用一般線性雙變量Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)

與對(duì)照組相比，URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)更低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別n外周血CD3+PD-1+T脫膜組織CD3+PD-1+T對(duì)照組2019.98±2.3731.09±4.05URSA組2014.27±1.3820.15±3.13t9.3119.558P<0.001<0.001

2.2 外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平

與對(duì)照組相比，URSA組IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

組別nIL-4ρ/(ng·L-1)IL-10ρ/(ng·L-1)IFN-γρ/(pg/mL)TNF-αρ/(ng·L-1)對(duì)照組2047.44±8.9216.65±5.0972.87±19.1322.61±9.06URSA組2024.65±9.087.38±2.11188.85±77.5945.52±15.69t8.0077.5246.4915.655P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 URSA與PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-10呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)；URSA與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 URSA與PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相關(guān)性

3 討論

在正常妊娠過(guò)程中，胚胎作為一種特殊的同種異體移植物，其在母體內(nèi)存活并正常發(fā)育，母體的免疫系統(tǒng)需對(duì)胚胎產(chǎn)生免疫耐受，而特異性免疫抑制物及非特異性因子，可共同維持母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的免疫耐受，同時(shí)機(jī)體的多種免疫學(xué)因素通過(guò)有機(jī)協(xié)調(diào)參與妊娠免疫平衡，若胚胎免疫耐受降低，則可能導(dǎo)致流產(chǎn)[3-4]。

目前，URSA的免疫因素研究主要包含經(jīng)典B7途徑的CD28、CTLA-4等，和Treg細(xì)胞及其相關(guān)的Th細(xì)胞因子。PD-1屬于細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)分子，可抑制T細(xì)胞活化，增殖負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答，并在調(diào)節(jié)免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)更低，IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高；經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-1呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)，與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)，提示URSA患者外周血和蛻膜組織中CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)降低，通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子，參與URSA發(fā)生。PD-1對(duì)維持免疫耐受及母胎免疫平衡，抑制免疫排斥具有重要意義，在正常妊娠中，PD-1可結(jié)合其配體PD-L1，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號(hào)，降低Th1細(xì)胞的增殖，阻礙IFN-γ、TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生，同時(shí)激活Th2細(xì)胞，使IL-4、IL-10等抑炎因子處于高表達(dá)，進(jìn)而維持免疫耐受[5]。IFN-γ對(duì)胚胎具有毒性作用，會(huì)抑制胚胎正常發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)現(xiàn)象[6]。但在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中，TNF-α?xí)cTNF受體大量結(jié)合，進(jìn)而阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖，干擾胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)供給，使胚胎著床難度增加[7]。IL-4、IL-10可維持正常妊娠，減少流產(chǎn)現(xiàn)象。因PD-1對(duì)單核細(xì)胞的抑制作用減弱，使URSA患者體內(nèi)處于高水平的炎癥狀態(tài)，抑炎性細(xì)胞因子減少，促炎因子增多,從而參與URSA發(fā)病[8]。造成URSA的主要原因是由于免疫耐受遭到破壞,但其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究和探討[9]。

總之，PD-1通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子而影響免疫平衡，參與URSA發(fā)病，可為治療URSA潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。