油酸對(duì)植物乳桿菌LIP-1生長及凍干存活率的影響及其機(jī)理

何宗柏，孫瑞胤，鄂晶晶，麻麗麗，張曉寧，王俊國

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌真空冷凍干燥技術(shù)可將乳酸菌懸液冷凍一定時(shí)間后，再提高其環(huán)境中的真空度，使菌體中的水分在低溫高真空度的環(huán)境下升華變成凍干菌粉[1]。由于真空冷凍干燥法制備的乳酸菌發(fā)酵劑具有遺傳穩(wěn)定、發(fā)酵活力高、貯藏條件好等優(yōu)點(diǎn)，成為乳酸菌發(fā)酵劑最常用的制備方法之一[2]。然而乳酸菌在冷凍干燥過程中，不可避免地受到一些損傷，凍干后的菌粉存活率明顯降低[3]。有研究表明，通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基組成成分，可提高菌株對(duì)冷凍干燥的抗性，從而提高凍干存活率[4]。

脂肪酸及其衍生物具有抑菌活性的報(bào)道國內(nèi)外并不少見，已有研究表明，脂肪酸及其衍生物對(duì)絲狀真菌、酵母菌、細(xì)菌的生長均有一定的抑制作用，抑制作用的強(qiáng)弱與碳鏈長度、不飽和鍵數(shù)目和位置有關(guān)，具體機(jī)制尚無定論。而脂肪酸及其衍生物對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用優(yōu)于革蘭氏陰性菌，有研究者認(rèn)為與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有關(guān)[5-6]。

近年來，長鏈脂肪酸及其衍生物的生理作用逐漸受到人們的關(guān)注。油酸（C18:1ω9c）是一種單不飽和ω-9脂肪酸，其化學(xué)式為C18H34O2（CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH），在自然界中廣泛存在，因此人們普遍認(rèn)可低劑量C18:1ω9c的安全性。Maciasr等[7]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)質(zhì)量濃度的C18:1ω9c可以提高硫胺素的活性，提高菌的產(chǎn)酸能力，菌的生長量有所增加。但C18:1ω9c對(duì)乳酸菌生長的影響還存在爭(zhēng)議，Sun等[8]比較了脂肪酸及其甘油單脂的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)C18:1ω9c和α-亞麻酸具有抑菌效果。這可能是因?yàn)橹舅岽x產(chǎn)生過多的自由基，對(duì)DNA造成了損傷[9]。有研究顯示，在乳酸菌培養(yǎng)基中添加C18:1ω9c、油酸鈉和吐溫-80可以提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的相對(duì)含量[10-11]。而大量研究表明，較高的細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量可以提高冷凍過程中形成的冰晶對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷[12]。但以C18:1ω9c作為誘導(dǎo)物質(zhì)提高凍干存活率的研究鮮見報(bào)道。

植物乳桿菌LIP-1是1 株從新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離出的具有降膽固醇益生功能的菌株[13]，減少菌株在冷凍干燥過程中的損傷，制備高活性、高存活率的益生菌制劑具有重要意義。本研究在MRS培養(yǎng)基中添加C18:1ω9c，以植物乳桿菌LIP-1為實(shí)驗(yàn)菌株，探究培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度C18:1ω9c與植物乳桿菌LIP-1發(fā)酵活菌數(shù)之間的關(guān)系，探究C18:1ω9c培養(yǎng)基對(duì)凍干存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌LIP-1由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

凍干保護(hù)劑：脫脂乳10.0 g、蔗糖8.0 g、L-谷氨酸鈉0.1 g、蒸餾水82 mL，115 ℃滅菌7 min，急冷，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氯仿-甲醇（1∶2，V/V）溶液；1 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液（13.5 g甲醇鈉溶于250 mL甲醇配制）；熒光染料LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit L7012 美國Invitrogen公司；β-半乳糖苷酶試劑盒 北京索萊寶試劑公司。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、大豆蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、無水磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸鈉2.0 g、七水硫酸鎂0.2 g、五水硫酸錳 0.05 g、吐溫-80 1 mL，加蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。MRS固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂12 g，121 ℃滅菌15 min。C18:1ω9c培養(yǎng)基：C18:1ω9c0.1～0.9 g、吐溫-80 1 mL、1 000 mL蒸餾水，充分溶解后，加入液體MRS培養(yǎng)基的其他成分，配制成C18:1ω9c培養(yǎng)基，121 ℃滅菌15 min。

以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；6850氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；DM4000B正置熒光顯微鏡 德國Leica公司；UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌LIP-1凍干粉接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下活化至3 代，再以2%的接種量接種于C18:1ω9c培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h后置于4 ℃保存?zhèn)溆茫藶閷?shí)驗(yàn)組，對(duì)照組以液體MRS培養(yǎng)基活化至4 代后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 活菌計(jì)數(shù)

以MRS固體培養(yǎng)基為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，采用稀釋平板菌落法計(jì)數(shù)。

1.3.3 真空冷凍干燥

在從C18:1ω9c培養(yǎng)基收集的菌泥中加入2 mL脫脂乳，充分混勻后取1 mL置于-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍6 h。冷凍后的樣品放在凍干機(jī)中，凍干24 h，真空度20 Pa，冷陷溫度-45 ℃。

1.3.4 植物乳桿菌LIP-1凍干存活率的測(cè)定

利用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定凍干前后活菌數(shù)，凍干后的菌粉用生理鹽水復(fù)水至凍干前的體積，并在37 ℃條件下培養(yǎng)10 min恢復(fù)活性，再采用MRS倒平板法，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行。凍干存活率按下式計(jì)算：

式中：A1為凍干后樣品活菌數(shù)/（CFU/mL）；A2為凍前樣品活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5 脂肪酸的提取及甲酯化

采用Bligh等[14]方法提取膜脂肪酸，后以甲醇鈉進(jìn)行甲酯化。C18:1ω9c培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后收集的菌體在4 ℃、4 000 r/min離心5 min，去上清液，洗滌2 次，棄上清液，取0.5 g濕菌泥，加入1.9 mL氯仿-甲醇溶液，充分振蕩15 min，加入0.625 mL氯仿及0.625 mL無菌去離子水，振蕩15 min后，4 ℃、5 000×g離心10 min，吸取下層液相，轉(zhuǎn)移到新的離心管里，用氮吹儀吹干。以甲醇鈉-甲醇溶液作為催化劑，在樣品中加入1 mL 1 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，冰浴下振搖5 min進(jìn)行甲酯化；加入0.6 mL正己烷萃取脂肪酸的甲酯，振蕩5 min，5 000×g離心5 min，吸取上層液相轉(zhuǎn)入氣相瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.6 細(xì)胞膜脂肪酸含量的氣相色譜測(cè)定

氣相色譜分析條件：P E G毛細(xì)管填充柱（30 m×0.22 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；流速：29.6 mL/min；總流量：0.5 mL/min；柱壓：63.4 kPa；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；柱溫升溫程序：起始溫度100 ℃，保持1 min，隨后以4 ℃/min的速率增至250 ℃并在250 ℃保持5 min。計(jì)算脂肪酸各峰的峰面積、保留時(shí)間及質(zhì)譜范圍，根據(jù)標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì)（37 種σ脂肪酸和C19cyc11的標(biāo)樣），對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定。

脂肪酸含量采用歸一化法，所有組分出峰之和按100%計(jì)算，各脂肪酸相對(duì)含量為該脂肪酸峰面積與總體脂肪酸峰面積和的比值。

1.3.7 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

細(xì)胞膜完整性利用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit L7012進(jìn)行測(cè)定。將熒光染料碘化丙啶和SYTO9等體積混合均勻。取3 μL混合染料，加入到1 mL菌懸液中，避光振蕩混合均勻，在室溫條件下，避光孵育15 min。取5 μL染色的菌懸液，滴加在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，壓緊，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.8 胞外β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定

取不同組別凍干菌粉樣品（菌數(shù)約為1×109CFU/mL），加0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液10 mL，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，各取上清液1 mL，用β-半乳糖苷酶試劑盒對(duì)3 組樣品的β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，酶活性的單位以U表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 C18:1ω9c質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長情況的影響

圖1 C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌LIP-1生長情況的影響Fig. 1 Effects of oleic acid concentration on the growth of L. plantarum LIP-1

目前，C18:1ω9c對(duì)菌生長的作用是促進(jìn)還是抑制存在爭(zhēng)議[7-8]，本實(shí)驗(yàn)探究在MRS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌LIP-1發(fā)酵活菌數(shù)的影響。由圖1可知，在培養(yǎng)基中低質(zhì)量濃度C18:1ω9c（≤0.2 g/L）可提高活菌數(shù)，高質(zhì)量濃度（≥0.3 g/L）C18:1ω9c會(huì)降低活菌數(shù)。相比于對(duì)照組，當(dāng)培養(yǎng)基中C18:1ω9c質(zhì)量濃度為0.1 g/L和0.2 g/L時(shí)，活菌數(shù)分別提高到7.6×109、7.4×109CFU/mL，兩組之間沒有顯著差異，說明低質(zhì)量濃度C18:1ω9c（≤0.2 g/L）能促進(jìn)菌的生長。可能是因?yàn)镃18:1ω9c提高了硫胺素的活性，提高了菌的能量代謝水平，促進(jìn)了菌的生長[7]。當(dāng)培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度提高到0.3 g/L時(shí)，活菌數(shù)開始降低；當(dāng)C18:1ω9c質(zhì)量濃度提高到0.6 g/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)不到對(duì)照組的1/3，這說明高質(zhì)量濃度C18:1ω9c（≥0.3 g/L）會(huì)抑制菌的生長。本研究表明，C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌最低抑制質(zhì)量濃度在0.2～0.3 g/L之間，促進(jìn)作用質(zhì)量濃度在0～0.3 g/L之間。

有研究表明脂肪酸及其衍生物（包括C18:1ω9c）對(duì)革蘭氏陽性菌具有抑菌活性[15]。宋宇航等[16]用透射電子顯微鏡觀察C18:1ω9c組菌體狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞膜變厚，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中的間隙增大，這樣有利于脂肪酸的跨膜運(yùn)輸，但也有可能引起細(xì)胞內(nèi)重要酶和功能蛋白的丟失。除此之外有文獻(xiàn)報(bào)道，不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化作用會(huì)產(chǎn)生具有抗菌活性的氧脂質(zhì)和短鏈醛[6,17]。由此推斷C18:1ω9c對(duì)菌株的益生作用與抑制作用存在一個(gè)平衡點(diǎn)，C18:1ω9c質(zhì)量濃度低于平衡點(diǎn)時(shí)，益生作用大于抑制作用，從而促進(jìn)菌的生長；當(dāng)C18:1ω9c質(zhì)量濃度大于平衡點(diǎn)時(shí)，C18:1ω9c會(huì)在細(xì)胞內(nèi)過多積累，產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物，對(duì)菌體產(chǎn)生抑制作用。

2.2 C18:1ω9c質(zhì)量濃度對(duì)菌株凍干存活率的影響

冷凍干燥中，由于水分的升華，細(xì)胞液濃縮，細(xì)胞外溶質(zhì)質(zhì)量濃度升高，形成高滲透壓的環(huán)境；低溫、高滲透壓、缺水的環(huán)境還會(huì)引起蛋白質(zhì)變性、酶活性降低、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的破壞[18]。這些不利條件和極端的環(huán)境，最終都會(huì)導(dǎo)致菌株的活力下降和凍干存活率的降低[19]。為提高凍干存活率，在菌株培養(yǎng)期間，優(yōu)化培養(yǎng)條件，使菌株獲得對(duì)冷凍干燥抗性，從而提高凍干存活率[4]。選取對(duì)植物乳桿菌LIP-1生長有促進(jìn)作用的C18:1ω9c添加質(zhì)量濃度0.1 g/L和0.2 g/L，與普通MRS培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，探究C18:1ω9c對(duì)菌株凍后活菌數(shù)及凍干存活率的影響。

從圖2可以看出，在培養(yǎng)基中添加C18:1ω9c，顯著提高了植物乳桿菌LIP-1凍后活菌數(shù)和凍干存活率。相比于對(duì)照組，0.1 g/L和0.2 g/L組凍干存活率分別提高了8.38%和4.46%，而0.1 g/L組與0.2 g/L組無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組凍后活菌數(shù)分別提高了1.18×109、7.19×108CFU/mL，而0.1 g/L組凍后活菌數(shù)要高于0.2 g/L組，可能是因?yàn)?.2 g/L組的菌體內(nèi)C18:1ω9c的有害代謝產(chǎn)物開始累積，并對(duì)菌產(chǎn)生了抑制作用[5]，但這種抑制作用與C18:1ω9c的積極作用存在一個(gè)平衡點(diǎn)，最終的結(jié)果是0.2 g/L凍后活菌數(shù)高于對(duì)照組，低于0.1 g/L組。總而言之，培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度C18:1ω9c能提高菌株凍后活菌數(shù)和凍干存活率，凍干存活率的提高與C18:1ω9c質(zhì)量濃度有關(guān)。可能的原因是，在培養(yǎng)期間，C18:1ω9c能促進(jìn)菌株合成不飽和脂肪酸，細(xì)胞膜的流動(dòng)性提高，增強(qiáng)了菌株對(duì)冷凍干燥的抗性，此推論在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 C18:1ω9c對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成的影響

研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加0.1 g/L C18:1ω9c，能促進(jìn)菌的生長，且能提高菌的凍干存活率，而0.2 g/L C18:1ω9c培養(yǎng)基的效果比0.1 g/L組略差。為探究低質(zhì)量濃度C18:1ω9c提高菌株凍干存活率的機(jī)理，以MRS培養(yǎng)基中收獲的菌為對(duì)照組，選取更有代表性的0.1 g/L C18:1ω9c培養(yǎng)基收獲的菌體為實(shí)驗(yàn)組，用氣相色譜法對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成進(jìn)行分析。

在冷凍干燥過程中，細(xì)胞膜的流動(dòng)性與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值有密切的關(guān)系，乳酸菌可以通過乳酸脫氫酶調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例[20-21]。細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸比例增加，可以降低膜從液晶態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)的溫度，保持菌株在冷凍干燥過程中細(xì)胞膜的流動(dòng)性，防止冰晶的形成對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷[22-23]。

表1 C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成的影響Table 1 Effects of oleic acid concentration on membrane fatty acid composition of L. plantarumLIP-1

從表1可知，對(duì)照組植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜主要由5 種脂肪酸構(gòu)成，分別為C16:0、C16:1、C18:0、C18:1ω9c和C19cyc11（此處作為不飽和脂肪酸），相對(duì)含量2%～40%不等，占細(xì)胞膜總脂肪酸比例的89%以上，說明這5 種脂肪酸是植物乳桿菌LIP-1的主要脂肪酸。除此之外還檢測(cè)到C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C14:1、C15:0、C17:0、C18:1t、C18:3，但因?yàn)楹斜壤^少或不能被穩(wěn)定檢測(cè)而沒有進(jìn)行比較分析。

總體上看，在培養(yǎng)基中添加C18:1ω9c，對(duì)植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成產(chǎn)生了很大的影響，主要體現(xiàn)為飽和脂肪酸含量降低，不飽和脂肪酸含量增加。當(dāng)培養(yǎng)基中含有0.1 g/L C18:1ω9c時(shí)，C16:0和C18:0相對(duì)含量不同程度下降，其中C16:0相對(duì)含量下降6.27%，C18:0下降7.2%。

C16:1、C18:1ω9c和C19cyc11相對(duì)含量不同程度增加。C18:1ω9c含量增加了3.52%，與以式脂肪酸和飽和脂肪酸的線性結(jié)構(gòu)不同，C18:1ω9c的順式結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)突出“結(jié)”的分子，這種特殊結(jié)構(gòu)能夠引起脂質(zhì)雙分子層疏水核心的改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加[24]。C19cyc11比例上升得最為顯著，增加了8.35%，這表明C18:1ω9c能促進(jìn)C19cyc11的合成。而C19cyc11決定了細(xì)胞膜的彈性和伸縮性，能防止脂肪酸過緊地結(jié)合到細(xì)胞膜上，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高凍干存活率[3,25]。此外，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值上升了0.45%，可能是因?yàn)镃18:1ω9c能誘導(dǎo)飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸。隨著不飽和脂肪酸含量的增加，菌株凍干存活率也顯著提高，相比對(duì)照組提高了8.38%。

2.4 相關(guān)性分析

表2 主要膜脂肪酸和生長量及凍干存活率相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis among fatty acids, biomass and freeze-drying survival rate

為進(jìn)一步確定C18:1ω9c與菌株細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成及凍干存活率之間的關(guān)系，對(duì)0.1 g/L C18:1ω9c培養(yǎng)基下收獲的菌株各主要脂肪酸、活菌數(shù)及凍干存活率作相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)及P值如表2所示。不飽和脂肪酸和C19cyc11的比例對(duì)菌應(yīng)對(duì)冷凍脅迫非常重要[10]。在C18:1ω9c的作用下，C19cyc11和不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著增加，而Pearson相關(guān)性分析表明，C19cyc11相對(duì)含量與凍干存活率呈顯著正相關(guān)。這表明C19cyc11能在冷凍干燥過程中對(duì)細(xì)胞起到的保護(hù)作用，與張國強(qiáng)等[26]的研究結(jié)果一致。C19cyc11可以提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，且由于其存在的環(huán)狀結(jié)構(gòu)決定了其化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜組成成分[27]。有研究表明C19cyc11由C18:1ω9c轉(zhuǎn)化而來，但本研究中，C19cyc11與C16:0之間呈顯著負(fù)相關(guān)，說明在C18:1ω9c的作用下，C16:0可轉(zhuǎn)化為C19cyc11，這可能是菌株之間差異性決定的，同時(shí)也說明不同菌株之間C19cyc11的生物合成方式存在差異。

C18:0與C18:1存在顯著負(fù)相關(guān)性，可推測(cè)培養(yǎng)基中的C18:1ω9c可以促進(jìn)飽和脂肪酸（C18:0）轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸（C18:1ω9c），提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的比例。不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值與凍干存活率存在顯著正相關(guān)性，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值越高，凍干存活率也越高。不飽和脂肪酸中的順式雙鍵能阻止脂肪酸分子之間的整齊排列，這種整齊的排列會(huì)導(dǎo)致脂肪膜的流動(dòng)性下降[21]。不飽和脂肪酸含量高還可降低細(xì)胞膜由液晶相轉(zhuǎn)化為凝膠相的溫度，從而提高細(xì)胞對(duì)低溫脅迫的抗性，減少細(xì)胞在冷凍干燥過程中的損傷[28]。這可能是C18:1ω9c提高菌株凍干存活率的一個(gè)重要原因。

此外，相關(guān)性分析還顯示出，C16:1相對(duì)含量與C18:0有較大的負(fù)相關(guān)系數(shù)，雖然不具有顯著性，但能顯示出在C18:1ω9c的作用下，短鏈脂肪酸有向長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。長鏈脂肪酸能降低細(xì)胞膜上H+的透過性，減緩細(xì)胞內(nèi)pH值的下降速率，維持細(xì)胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)平衡，以維持細(xì)胞的正常生理功能[29]。這可能是C18:1ω9c提高菌株凍干存活率的另一個(gè)潛在原因。

2.5 C18:1ω9c對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜的完整性直接關(guān)系到細(xì)胞的活性，細(xì)胞膜的完整性受到破環(huán)，生理功能必然受到影響[30]。碘化丙啶是一種排斥性染料，可以對(duì)DNA染色，只有細(xì)胞膜完整性被破壞的細(xì)胞才允許染料進(jìn)入胞漿，因此碘化乙啶可區(qū)分細(xì)胞膜是否完整的細(xì)胞[31]。

圖3 C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌LIP-1冷凍干燥后細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 3 Effect of oleic acid concentration on cell membrane integrity of L. plantarum LIP-1 after freeze-drying

圖3 顯示，從含0.1 g/L C18:1ω9c培養(yǎng)基中收獲的菌體進(jìn)行冷凍干燥后，發(fā)出紅色熒光的菌體明顯少于另外兩組，這說明菌體細(xì)胞膜完整性維持得較好。與沒有添加C18:1ω9c的對(duì)照組相比，0.2 g/L組發(fā)出紅色熒光的菌體少于對(duì)照組，這說明該組菌體細(xì)胞膜的完整性受到破壞的程度小于對(duì)照組，冷凍干燥對(duì)對(duì)照組的影響大于實(shí)驗(yàn)組。在冷凍干燥的預(yù)凍階段，細(xì)胞內(nèi)外都會(huì)形成冰晶，對(duì)細(xì)胞膜造成機(jī)械損傷，破壞細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞膜的通透性增加，胞內(nèi)的關(guān)鍵酶如β-半乳糖苷酶、ATP酶等，蛋白質(zhì)和離子發(fā)生泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低[32-33]。這很好地解釋了0.1 g/L組與0.2 g/L組具有較高凍干存活率的原因。同時(shí)也間接驗(yàn)證了培養(yǎng)基中低質(zhì)量濃度的C18:1ω9c可以誘導(dǎo)飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化，促進(jìn)C19cyc11合成，提高了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。

2.6 C18:1ω9c對(duì)植物乳桿菌LIP-1胞外β-半乳糖苷酶活性的影響

β-半乳糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，一般不能在胞外檢測(cè)到活性，其在上清液中活性能以映細(xì)胞膜通透性的改變，當(dāng)細(xì)胞膜的完整性受到破壞時(shí)，細(xì)胞膜通透性增大，β-半乳糖苷酶會(huì)泄露到細(xì)胞外，導(dǎo)致上清液中β-半乳糖苷酶活性增加[18]。

圖4 C18:1ω9c對(duì) 植物乳桿菌LIP-1凍干后β-半乳糖苷酶活性的影響Fig. 4 Effect of oleic acid concentration on β-galactosidase activity in supernant of freeze-dried L . plantarum LIP-1

由圖4可知，MRS組、0.1 g/L組和0.2 g/L組凍干后胞外β-半乳糖苷酶活性分別為1.68×10-2、1.20×10-2U/mL和1.33×10-2U/mL，0.1 g/L組、0.2 g/L組冷凍干燥后胞外β-半乳糖苷酶活性均低于MRS組，0.1 g/L組低于0.2 g/L組，差異顯著（P＜0.5）。冷凍干燥過程會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞膜造成一定程度的損傷，細(xì)胞膜的通透性增大，泄漏到細(xì)胞外的β-半乳糖苷酶增加[22]。本研究中0.1 g/L組和0.2 g/L組胞外β-半乳糖苷酶活性低于MRS組，表明培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度C18:1ω9c能有效阻止β-半乳糖苷酶的泄露。培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度C18:1ω9c可提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，降低冷凍過程中冰晶對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，使細(xì)胞膜的完整性維持較好，因而0.1 g/L組和0.2 g/L組β-半乳糖苷酶泄漏量低于MRS組。

3 結(jié) 論

培養(yǎng)基中低質(zhì)量濃度（≤0.2 g/L）的C18:1ω9c可以促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1生長，提高凍干存活率。培養(yǎng)基中高質(zhì)量濃度C18:1ω9c會(huì)抑制菌的生長，最低抑制質(zhì)量濃度在0.2～0.3 g/L之間。低質(zhì)量濃度C18:1ω9c可以促進(jìn)C16:0轉(zhuǎn)化為C19cyc11，同時(shí)誘導(dǎo)飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化，通過這兩條途徑提高菌體對(duì)冷凍干燥的抗性。