聚賴氨酸偶聯活性氧誘導釀酒酵母細胞凋亡

侯 穎，馬文瑞，程雅文，鄭浩然，譚之磊，賈士儒

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

細胞死亡是維持機體正常發展的一個重要過程，有機體生長發育或組織在清除多余或受損細胞時，維持機體完整性的生命特征[1-2]。細胞死亡一般分為主動死亡和被動死亡兩種形式[3]。其中，細胞凋亡是一種由基因表達調控的細胞主動死亡的過程，凋亡細胞體積變小，形態逐漸變圓，脫離相鄰的細胞[4]。釀酒酵母是單細胞真菌微生物，遺傳信息分析研究較為全面透徹，其細胞凋亡生化表征與哺乳動物細胞十分相似，研究細胞凋亡的相關機制，可以作為一類優勢的模式生物[5-6]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是細胞凋亡重要的誘導劑，ROS過量產生會使胞內大分子發生染色質濃縮，DNA片段化，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻等氧化損傷，進而開啟細胞凋亡途徑[7]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種攜帶氨基的陽離子表面活性劑，由25～35 個L-賴氨酸組成，通過ε-氨基和α-羧基縮合而成的堿性氨基端同聚物，也稱堿性聚酰胺，其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用[8-9]。因此，ε-PL的抑菌機制及其應用受到廣泛關注。薄濤等[10]研究了不同質量濃度ε-PL對釀酒酵母的抑菌機制，結果表明隨著ε-PL質量濃度升高，細胞膜通透性和疏水性升高，細胞活性降低，并確定了亞致死質量濃度為200 μg/mL，致死質量濃度為500 μg/mL。同時，薄濤等[10]研究了ε-PL濃度對釀酒酵母細胞壁的影響，細胞壁壓力實驗結果表明，ε-PL處理會對其細胞壁產生擾動，變得更加脆弱。在亞致死濃度ε-PL處理組中，細胞壁的主要組成成分磷酸甘露糖和幾丁質含量隨著ε-PL處理濃度上升而顯著上升，β-1,3-葡聚糖含量并沒有顯著變化，透射電子顯微鏡照片顯示釀酒酵母細胞壁沒有明顯變化。在致死濃度ε-PL處理組中，上述3 種主要組成成分含量較對照組均顯著上升；細胞壁某些位點明顯斷裂，細胞內物質流出。與此同時，雙氫羅丹明123和DAPI染色實驗結果顯示亞致死濃度ε-PL處理還會引起釀酒酵母胞內ROS積累和DNA斷裂[11]。譚之磊等[12]將ε-PL與帶負電荷的卵白蛋白形成帶不同電荷的復合物，通過靜電作用減少與大腸桿菌的相互作用，從而降低抑菌效果。Ye Rusong等[13]研究發現ε-PL會造成大腸桿菌氧化脅迫，使DNA損傷應答調節基因的表達受到影響。Zhao Ruifang等[14]將ε-PL與陽離子聚合物形成可降解的復合納米粒子，研究對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性并分析其在藥物包封率和抑菌性的應用潛力。但是關于ε-PL與微生物凋亡的相關研究鮮有報道。

本研究以釀酒酵母為模式真菌，研究ε-PL對酵母細胞凋亡的影響及其相關機制，解析ROS與細胞凋亡的偶聯關系，旨在為ε-PL的抑菌機理和真菌細胞凋亡機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AS2399由天津科技大學菌種保藏中心保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

ε-PL（≥99%） 浙江新銀象生物技術有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 江蘇佰耀生物科技有限公司；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；JC-1線粒體膜電位試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；磷酯酰絲氨酸外翻檢測試劑盒 美國BD公司；原位末端凋亡（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測試劑盒 瑞士Roche公司。

1.2 儀器與設備

SPD2010-230正置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Multiskan MK3全自動酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細胞前處理

NAC是一種常見的抗氧化劑，具有干擾自由基生成、清除已生成自由基、調節細胞代謝活性、預防DNA損傷、抗細胞凋亡等功能[15]。為進一步探究ROS在ε-PL抑菌過程中的作用，將抗氧化劑NAC與ε-PL共同作用于釀酒酵母。

活化好的酵母培養液初始細胞密度OD600nm值達到0.3～0.4時，添加ε-PL和NAC，28 ℃、180 r/min條件下連續培養8 h后終止培養。其對照處理組中，一組樣品僅有細胞培養液，作為空白對照，另一組向細胞培養液中再加入終濃度為10 mmol/L NAC溶液。ε-PL處理組中，一組需要分別加入200、500 μg/mL的ε-PL溶液，另一組需要分別加入200、500 μg/mL的ε-PL溶液后，再分別加入10 mmol/L NAC溶液。每組樣品制備3 份。

1.3.2 釀酒酵母細胞形態觀察

參照Hair等[16]的方法并加以改良，細胞培養方法同1.3.1節。

1.3.3 釀酒酵母細胞熒光顯微鏡檢測

1.3.3.1 ROS檢測

2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHD A）進入細胞后水解生成2,7-二氯二氫熒光素（2,7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH），被裝載到細胞內后，ROS能夠氧化無熒光的DCFH生成有綠色熒光的2,7-二氯熒光素（2,7-dichlorofluorescein，DCF）。通過檢測DCF的熒光程度，可以得出細胞內ROS的水平[17]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，具體如下：首先，低速離心收集酵母細胞液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次細胞。其次使用DCFH-DA重懸細胞，37 ℃培養箱內孵育20 min，每隔3～5 min輕微顛倒混勻，使探針和細胞充分接觸。然后使用空白培養基洗滌細胞3 次，再次使用PBS洗滌2 次并重懸。最終取200 μL菌液加入96 孔板中，酶標儀檢測。同時取適量菌液，制片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.2 磷酯酰絲氨酸外翻檢測

異硫氰酸熒光素-膜聯蛋白V（fluorescein isothiocyanate-Annexin V，FITC-Annexin V）利用細胞凋亡早期的細胞膜不對稱性，確定凋亡細胞的比例。Annexin V是一種鈣離子依賴型的磷脂結合蛋白，對PS有較高的吸附性，同時FITC能夠產生綠色熒光。碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種標準的流式紅色探針，細胞膜完整時可以將PI排出胞外，以之，PI完全進入細胞。因此，使用Annexin V和PI熒光探針分辨存活和死亡細胞。FITC陽性且PI陰性的細胞即為凋亡細胞，FITC和PI雙陽性的細胞是凋亡后期、正在壞死或者已經死亡的細胞，FITC和PI雙陰性的細胞是正常細胞或者還未檢測到凋亡的細胞[18]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細胞液，PBS清洗2 次細胞。然后使用染色緩沖液重懸細胞，取100 μL菌懸液到5 mL離心管中；同時加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI染色液，輕微顛倒混勻，25 ℃黑暗孵育15 min，最后加入400 μL染色緩沖液。制片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.3 染色質固縮檢測

藍色熒光染料Hoechst 33342和PI均可與細胞核DNA或RNA結合，Hoechst穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，PI可以染色壞死細胞。雙染后，正常細胞則呈現為弱紅色熒光+弱藍色熒光，細胞核內有較深的藍色顆粒，凋亡細胞為弱紅色熒光+強藍色熒光，核內濃集而呈亮藍色，壞死細胞為強紅色熒光+強藍色熒光，核內呈紅色[19]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細胞液，用PBS清洗2 次細胞。加入5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色，輕微顛倒混勻，4 ℃黑暗孵育20～30 min后，離心沉淀細胞，使用PBS再次洗滌細胞，涂片，使用熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.4 線粒體膜電位檢測

親脂性陽離子熒光染料JC-1結合到線粒體基質并產生紅色熒光，其熒光強度說明膜電位的狀態。以之，線粒體跨膜電位耗散，細胞進入不可逆的凋亡過程，JC-1單體產生綠色熒光[20-21]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細胞液，用PBS清洗2 次細胞。使用0.5 mL YPD培養基重懸細胞后，再次加入0.5 mL JC-1染色液，立即混勻，37 ℃恒溫靜置20 min。4 ℃、600×g離心4 min，棄上清液。然后使用JC-1染色緩沖液洗滌2 次細胞，再次使用緩沖液重懸細胞，4 ℃、600×g離心4 min，沉淀細胞，棄上清液，重復2 次。最后將細胞重懸使用熒光顯微鏡。

1.3.3.5 DNA損傷檢測

TUNEL法能夠檢測DNA損傷。細胞發生凋亡時，部分DNA內切酶被激活，會切斷核小體間的基因組DNA。在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下，基因組DNA斷裂后3’-OH能夠結合綠色熒光探針FITC標記的脫氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP），使用熒光顯微鏡檢測[22]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細胞液，用PBS清洗2 次細胞。使用0.5 mL YPD培養基重懸細胞后，再次加入10 μL TUNEL染色液，立即混勻。37 ℃恒溫孵育2 h，期間，每隔10 min上下顛倒混勻。37 ℃孵育結束后，4 ℃、600×g離心10 min，棄上清液，再次使用PBS洗滌并重懸細胞。取適量菌液，制片，使用熒光顯微鏡觀察。

1.4 數據分析

使用SPSS 20.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母菌細胞生長密度結果

通過測定釀酒酵母8 h后的細胞密度OD600nm值，觀察菌體的生長情況，結果見圖1。ε-PL處理組中，C組釀酒酵母的OD600nm值與A組細胞密度相比降低了83.7%，細胞生長受到明顯抑制。E組的OD600nm值與初始接種OD600nm值基本一致，細胞死亡率接近100%，活性完全受到抑制。但是加入NAC，D組的OD600nm值升高49.8%。

圖1 釀酒酵母細胞密度OD600 nm值Fig. 1 Cell density (OD600 nm) of S. cerevisiae

2.2 釀酒酵母細胞形態觀察結果

通過掃描電子顯微鏡觀察釀酒酵母形態變化，如圖2所示。所有樣品的細胞大小沒有明顯變化。對照組細胞形態完整，表面光滑飽滿。ε-PL處理組中，C組細胞膜表面粗糙并有明顯的凹陷，E組細胞膜表面粗糙，出現明顯的凹陷、孔洞和細微凸起。加入NAC后的處理組細胞形態與ε-PL處理組無明顯差異。

圖2 ε-PL質量濃度對釀酒酵母細胞形態的影響Fig. 2 Effect of ε-PL concentration on cell morphology of S. cerevisiae

2.3 釀酒酵母細胞熒光顯微鏡檢測結果

2.3.1 ROS檢測結果

DCFH-DA探針檢測釀酒酵母細胞胞內ROS含量，圖3結果顯示，對照組中，A組和B組熒光強度一致。ε-PL亞致死濃度處理組中，C組熒光強度較A組增加了1.47 倍，ROS顯著積累，加入NAC后，D組的熒光強度較C組降低了54.6%。致死濃度處理組中，E組與A組相比減少了9%，說明細胞死亡過多，ROS含量減少，加入NAC后，F組的熒光強度較E組降低了21.1%。結合細胞密度和形態觀察結果，說明ε-PL誘發細胞ROS含量上升，使細胞活性受到抑制，同時NAC能夠緩解ε-PL對釀酒酵母細胞活性的抑制作用。

圖3 ε-PL質量濃度對釀酒酵母ROS含量的影響Fig. 3 Effect of ε-PL concentration on intracellular ROS content of S. cerevisiae

通過DCFH-DA探針對樣品進行染色觀察，圖4結果顯示，對照組中，A組和B組均未發現綠色熒光細胞。ε-PL處理組中，亞致死濃度C組的綠色熒光細胞強度和數量最高，致死濃度E組出現少量綠色熒光細胞并且熒光強度降低，說明大部分細胞壞死，ROS含量降低，但是仍有小部分細胞出現ROS迸發現象。加入NAC后的處理組熒光強度均降低，說明外源添加NAC能夠抑制胞內ROS含量。

圖4 ε-PL質量濃度對釀酒酵母ROS的影響Fig. 4 Effect of ε-PL concentration on intracellular ROS of S. cerevisiae

2.3.2 磷酯酰絲氨酸外翻檢測結果

通過Annexin V-PI探針對樣品進行染色觀察，圖5結果顯示，A組未發現綠色或紅色細胞，證明無磷酯酰絲氨酸外翻現象和細胞壞死現象。ε-PL處理組均出現FITC陽性且PI陰性的綠色細胞和FITC和PI雙陽性的紅色細胞，說明ε-PL會使釀酒酵母細胞磷酯酰絲氨酸外翻，其中，亞致死濃度處理組的綠色熒光細胞數量相比致死濃度組多，說明在亞致死濃度下，細胞膜較完整，未被PI染色，細胞能夠較長時間處于細胞凋亡早期階段。致死濃度處理組多數細胞呈現紅色熒光，說明致死濃度下大量細胞發生壞死。

圖5 ε-PL質量濃度對釀酒酵母磷酯酰絲氨酸外翻的影響Fig. 5 Effect of ε-PL concentration on phosphatidylserine externalization of S. cerevisiae

2.3.3 染色質固縮檢測結果

通過Hoechst 33342-PI探針對樣品進行染色觀察，細胞出現藍色說明染色質固縮，這一現象是細胞凋亡的顯著特征之一。圖6結果顯示，A組中多數細胞為淡藍色熒光，其中，內部有深藍色顆粒，即為正常細胞。ε-PL處理組出現3 種細胞，第1種是正常細胞，第2種是細胞核內有分散的亮藍色細胞即為凋亡細胞，第3種是有紅色熒光背景的藍色壞死細胞，說明ε-PL會使細胞染色質固縮。但是加入NAC后的處理組，凋亡細胞數量明顯增多。

圖6 ε-PL質量濃度對釀酒酵母染色質固縮的影響Fig. 6 Effect of ε-PL concentration on chromatin pyknosis of S. cerevisiae

2.3.4 線粒體膜電位檢測結果

圖7 ε-PL質量濃度對釀酒酵母線粒體膜電位的影響Fig. 7 Effect of ε-PL concentration on mitochondrial transmembrane potential of S. cerevisiae

通過JC-1探針對樣品進行染色觀察，圖7結果顯示，對照組中，A組和B組均為紅色熒光細胞，說明線粒體膜電位較高，細胞生長狀態良好。ε-PL處理組出現兩種熒光細胞，一種是紅色熒光細胞；另一種是綠色熒光細胞，說明線粒體膜電位較低，部分細胞處于凋亡或死亡階段。其中，致死濃度E處理組綠色熒光細胞數量和強度最高，亞致死濃度C組次之，說明隨著ε-PL質量濃度升高，線粒體膜電位耗散程度增強，細胞死亡，抑菌活性增強。與此同時，加入NAC后的處理組，綠色熒光強度均明顯降低，線粒體膜電位耗散程度降低。

2.3.5 DNA損傷檢測結果

通過TUNEL對樣品進行染色觀察，圖8結果顯示，對照組中，A組和B組均未出現綠色熒光細胞。ε-PL處理組中，亞致死濃度C組和致死濃度E組均出現綠色熒光細胞。加入NAC后，亞致死濃度D組未出現熒光細胞，致死濃度F組中熒光細胞相對減少，可以降低DNA損傷。

圖8 ε-PL質量濃度對釀酒酵母DNA損傷的影響Fig. 8 Effect of ε-PL concentration on DNA damage in S. cerevisiae

3 討 論

ε-PL作為一種天然綠色的防腐劑，其抑菌性能已經得到國內外研究者的廣泛研究。Hyldgaard等[23]以大腸桿菌和李斯特菌為模式菌株，檢測了二價陽離子對ε-PL抑菌活性的影響。周祺等[24]以腸球菌為研究對象，分析ε-PL對其的抑菌機制，結果發現ε-PL通過改變細胞膜通透性，進而改變膜內外電位，使得細胞大分子滲出并與DNA結合，從而實現抑菌作用。蔡瑞等[25]以不同質量濃度ε-PL研究了脂環酸芽孢桿菌最小抑菌濃度并將其應用在模擬蘋果汁中，檢測菌落數和愈創木酚變化趨勢。孫鏈等[26]以不同貯藏溫度和時間為單因素，研究了ε-PL對牛肉火腿切片的細菌總數、乳酸菌和大腸桿菌的抑制效果。陳曉青等[27]研究ε-PL質量濃度對金黃色葡萄球菌生長曲線和生物膜形成的影響，結果表明ε-PL質量濃度越高，對其抑制效果越好，并且生物膜形成能力下降。本課題研究了釀酒酵母菌細胞初始密度達到一定值后，添加不同質量濃度的ε-PL和抗氧化劑NAC，分析細胞生長密度的變化，結果顯示亞致死濃度ε-PL的細胞生長密度與空白對照組相比降低了83.7%，致死濃度ε-PL的細胞密度基本不變，但是加入NAC后，其細胞生長密度升高了49.8%，表明加入NAC后可以有效控制細胞活性。同時，掃描電子顯微鏡觀察細胞形態發現，亞致死濃度下細胞表面不光滑，部分細胞表面出現凹陷。致死濃度下細胞表面粗糙，出現明顯的凹陷和細微凸起，細胞膜造成嚴重損傷，這一結果與薄濤等[10]研究結果一致。

真核酵母細胞ROS水平上升，與抗氧化作用失衡，造成蛋白質、核酸和膜脂等大分子物質氧化損傷，進而生理活動異常誘發細胞凋亡。王興華等[28]研究了鎘誘導對酵母細胞作用的死亡機制，結果表明鎘處理可以降低細胞活性，ROS含量升高，誘導細胞死亡，但是外源添加抗氧化劑或Ca2+，細胞死亡數量明顯降低。Madeo[29]研究了氧脅迫對酵母細胞凋亡的影響機制，結果表明，胞內谷胱甘肽的消耗或外源低劑量H2O2的加入，可以誘導釀酒酵母細胞凋亡。同時，酵母也可以通過基因CDC48的突變或哺乳動物Bax的表達觸發細胞凋亡。在這兩種情況下，結果顯示胞內氧自由基積聚，而自由基耗盡或缺氧則阻止細胞凋亡。劉慶菊等[30]研究了D-氨基酸對釀酒酵母的氧化損傷機制，結果表明，D-氨基酸誘導胞內產生以H2O2為主要類型的ROS物質，細胞產生毒性并抑制其生長。本課題利用探針染色和熒光顯微鏡技術，研究了不同質量濃度ε-PL對酵母細胞活性的抑制機制，結果表明，ε-PL處理組的釀酒酵母細胞均出現磷酯酰絲氨酸外翻、染色質固縮、線粒體膜電位耗散和DNA損傷現象，其中，在亞致死濃度下，ROS熒光強度最高，說明ε-PL能夠誘導釀酒酵母細胞ROS迸發，使細胞進入凋亡早期階段。在致死濃度下，ROS含量相對減少，說明ε-PL濃度過高可使細胞直接進入凋亡后期階段直至死亡。外源添加抗氧化劑NAC后，ROS熒光強度下降，細胞凋亡特征的熒光強度均降低，說明NAC能夠清除胞內ROS，使ε-PL的抑菌活性降低。

4 結 論

ε-PL對酵母細胞活性有一定的抑制作用，不同質量濃度的ε-PL抑制效果不一致，其中亞致死濃度下誘導ROS迸發，使細胞進入凋亡早期階段，致死濃度下能使細胞進入凋亡后期階段直至死亡，同時外源添加抗氧化劑NAC可清除胞內ROS，有效抑制ε-PL的抑菌活性。