食品中肌醇測定用菌株的篩選及檢測方法建立和應用

張 寧，范 迪，楊 燕，王 贏，徐 瓊，崔學文，房玉國，聞宏亮，秦 峰，劉 浩，范一靈,

（1.國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；2.上海質量監督檢驗技術研究院，上海 200233；3.上海海關，上海 200135；4.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 611731；5.國家乳制品質量監督檢驗中心，黑龍江 哈爾濱 150086）

肌醇又稱環己六醇，是一種具有生物活性的環狀糖醇。1928年，Eastcott首次制備了純凈態的肌醇[1]。1940年Wooley首次發現肌醇具有抗脫毛作用，從而揭開了肌醇具有維生素活性這一特性。研究發現，肌醇理論上具有9 種立體異構體[2-4]，其中內消旋(1,2,3,5-順式)環己醇具有維生素生物活性。

肌醇廣泛分布于動植物體內，幾乎所有的生物中都含有游離態或結合態肌醇，是生物體生命活動不可缺少的物質[5]，特別是在全谷物和柑橘類水果內。肌醇通過磷酸化和去磷酸化以應形成帶有不同數量磷酸基團的衍生物，參與各種生物代謝過程[6]，具有多種生理藥理活性[7]，廣泛應用于飼料[8-9]、食品[10]、醫藥[11-13]等行業。醫藥行業中，肌醇能促進脂肪代謝，防止體內脂肪累積，具有免疫、預防和治療某些疾病等作用[14-16]。食品工業中，肌醇是人體多類型細胞的必需生長因子，尤其在胎兒及兒童生長發育過程中發揮關鍵作用[17]，因此，其作為一種營養強化劑添加于嬰幼兒配方乳粉及特殊膳食食品中。

國內外有關肌醇檢測的方法主要有色譜法（氣相色譜法[18-20]、氣相色譜-質譜法[21-22]、高效液相色譜法[23]、液相色譜-質譜法[24]、離子色譜法[25]）和微生物法[8,26]。目前，國際標準關于肌醇檢測的方法均為理化檢驗法，涉及的方法有AOAC 2011.18的液相色譜法、AOAC 2012.12的離子色譜法以及ISO 20637:2015的液相色譜法，上述方法適用基質均為嬰幼兒和成人營養配方食品；國內關于肌醇檢測的標準主要有GB 5009.270—2016《食品中肌醇的測定》、GB/T 5009.196—2003《保健食品中肌醇的測定》、NY/T 1345—2007《添加劑預混合飼料中肌醇的測定》、GB/T 23879—2009《飼料添加劑 肌醇》，涉及的方法主要以理化色譜法為主，僅GB 5009.270—2016中涉及到微生物法。色譜法主要適用于含量較高、基質成分簡單的強化食品中肌醇的測定；微生物法基于某些微生物對肌醇利用的特異性，具有高靈敏度，更適合含量較低、基質成分復雜的天然食品中肌醇的測定。然而，在實際應用中，GB 5009.270—2016中的微生物法[26]在測試菌株肌醇利用特異性、方法操作步驟及終點判斷原則規范化等方面仍需改進及明確，因此，本研究分別從肌醇利用特異性菌株的篩選、菌懸液的制備方式、標準曲線的擬合方式及培養終點時間的判斷等方面進行方法探索，從而對該國標的方法進行優化改良，最終以不同類別的食品為基質，進行實驗室間的方法驗證，分別考察方法的精密度、回收率及重現性，最終獲得可靠穩定的用于肌醇測定的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌：Saccharomyces cerevisiae CICC 32919、ATCC 9080、ACCC 20065；葡萄汁酵母菌：S. uvarum CICC 1465、CICC 31161、ACCC 20202。

肌醇測定培養基 青島日水生物科技有限公司；麥芽汁浸粉瓊脂培養基、麥芽汁肉湯培養基 上海瑞楚生物科技有限公司；肌醇標準品（純度99.5%） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Infinite F200 PRO型酶標儀 瑞士Tecan公司；UV2450分光光度計 日本島津公司；PYX-DHS-600-BS型恒溫培養箱 上海賀德實驗設備有限公司；SI-600R型振蕩培養箱 韓國Jeiotech公司；HV-110型壓力蒸汽消毒器 日本Hirayama公司。

1.3 方法

1.3.1 肌醇標準溶液的配制

按照GB 5009.270—2016中3.4節標準溶液配制[26]。

1.3.2 接種菌懸液的制備

將菌株活化后接種至麥芽浸粉瓊脂斜面培養基，（30±1）℃培養2～3 d后，制成貯備菌種，貯于4 ℃冰箱中，保存期不要超過2 周。

使用前1 d，將保存菌種轉接至10 mL滅菌麥芽浸粉液體培養基，（30±1）℃培養20～24 h。取麥芽浸粉液體培養基培養物，無菌條件下2 000 r/min離心15 min，傾去上清液。加入10 mL無菌0.9%氯化鈉溶液，重新分散細胞，于旋渦混合器上快速混合均勻，離心15 min，傾去上清液。重復離心和清洗步驟3 次。最后一次細胞分散液用無菌0.9%氯化鈉溶液懸浮，制成混懸液，備用。用紫外-可見分光光度計，以無菌0.9%氯化鈉溶液作空白，550 nm波長處測定接種菌懸液的透光率，調整加入的菌液量或者加入一定量的無菌0.9%氯化鈉溶液使該菌懸液透光率在60%～80%之間，盡快使用。

1.3.3 樣品處理

樣品前處理：薏米樣品粉碎、研磨、過篩；南瓜粉及豬肝粉樣品用前混勻；飲料樣品用前振搖混勻。

樣品提取：準確稱取含肌醇0.50～2.00 mg的上述試樣于250 mL錐形瓶中，固體試樣加入80 mL 0.44 mol/L鹽酸溶液，液體試樣加入100 mL 0.44 mol/L鹽酸溶液，混勻。將錐形瓶以鋁箔紙覆蓋，在滅菌釜中125 ℃水解1 h。取出，冷卻至室溫，加入約3 mL 12.5 mol/L氫氧化鈉溶液，冷卻。用適宜濃度的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調pH 5.2±0.1，轉入250 mL容量瓶中，定容至刻度。混勻，過濾，收集濾液。調整濾液稀釋倍數，使待測液肌醇質量濃度在0.1～1.0 μg/mL范圍內，作為試樣提取液。

1.3.4 標準曲線及待測液系列管制作

1.3.4.1 標準曲線管的制作

按照GB 5009.270—2016中5.4節標準曲線的制作[26]。

1.3.4.2 待測液系列管的制作

按照GB 5009.270—2016中5.5節待測液的制作[26]。

1.3.4.3 接種及培養

向1.3.4.1節和1.3.4.2節中所有的試管各加入玻璃珠1 顆，121 ℃、5 min滅菌，迅速冷卻，將1.3.2節制備好的接種菌懸液向上述試管內（除對照管）各加約150 μL，混勻，（30±1）℃振蕩培養。

1.3.4.4 96 孔板中的加樣制備及培養

系列管按1.3.4.1節和1.3.4.2節制作后，每孔加入200 μL制備液，將孔板置于酶標儀中，（30±1）℃振蕩培養48 h，培養過程中每小時檢測一次OD550nm。

1.3.5 肌醇測定菌株的篩選

按照1.3.4.1節分別制備對照管（S1）3 管，無肌醇培養體系（S2：肌醇質量濃度0 μg/mL）及高質量濃度肌醇培養體系（S10：肌醇質量濃度1 μg/mL）各18 管。按照1.3.2節方法將6 株酵母菌分別制備接種菌懸液，將制備好的6 株菌菌懸液分別按照1.3.4.3節接種至上述S2、S10管（每株菌每管平行制備各3 管），將制備好的培養體系分別按照1.3.4.4節方法進行96 孔板的加樣制備及培養。

1.3.6 肌醇測定菌株培養時間的考察

按照1.3.4.1節分別制備3 管S1及若干管S10。按照1.3.2節方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節方法接種至上述S10管，（30±1）℃培養24 h后，每隔1 h取樣測定OD550nm，以時間為橫坐標，OD550nm為縱坐標，繪制S. uvarum CICC 1465的生長曲線。

1.3.7 肌醇測定菌株標準曲線的繪制

按照1.3.4.1節進行標準曲線管的制作，按照1.3.2節方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節接種至上述標準曲線管并培養，以肌醇質量濃度為橫坐標，不同肌醇質量濃度下菌株生長OD550nm為縱坐標，進行標準曲線的繪制，采用四參數Logistic擬合方式。四參數Logistic模型的方程如下：

式中：A、B、C、D為擬合曲線的4 個特征性參數，其中，A為以應下限值，D為以應上限值，B為曲線的斜率因子，C為半數有效濃度（EC50）。

1.3.8 培養終點期菌株生長變化量的考察

按照1.3.4.1節進行標準曲線管的制作，按照1.3.2節方法制備S. uvarum CICC 1465菌懸液，按照1.3.4.3節接種至上述標準曲線管并培養，培養至38 h后，每隔2 h測定S10管的OD550nm，最終以6 次獨立實驗結果進行統計分析。

1.3.9 方法學驗證

驗證單位：4 家國內食品檢驗檢測實驗室，編號1～4。

驗證方法：以S. uvarum CICC 1465為測試菌株，按照1.3.1～1.3.3、1.3.4.1～1.3.4.3節方法進行實驗，采用四參數Logistic方程進行標準曲線擬合，終點判斷原則為培養約38 h后，同等條件下每隔2 h監測最高質量濃度標準曲線管S10，測定其OD550nm，兩次OD550nm的絕對差結果不大于5%時，終止培養，一般培養時間不超過44 h。通過上述方法進行樣品中肌醇含量的測定。

驗證樣品：維生素功能飲料、豬肝粉、南瓜粉及薏米粉。

精密度驗證：每個實驗室分別對每種試樣進行7 次獨立測定實驗。

回收率驗證：每個實驗室分別對每個樣品進行試樣與標準品1∶1加標回收率實驗。

重現性驗證：綜合對4 家實驗室測定的4 種樣品的肌醇含量進行重現性分析。

2 結果與分析

2.1 肌醇測定菌株的篩選

肌醇是酵母菌生長必須的生長因子[27]，有些酵母菌自身能夠合成細胞生長所需的肌醇[28]，而有些酵母菌卻是天然的肌醇缺陷型，必須依賴培養基中的外源肌醇[29]。因此，本研究基于此原理，分別從大量酵母菌中選擇6 株常用于維生素檢測的酵母菌，進行肌醇測定菌株的篩選。

圖1 肌醇對不同菌株生長的特異性Fig. 1 Effect of inositol concentration on the growth specificity of different strains

由圖1可知，與每株菌在S10中生長趨勢相比較，S. cerevisiaeATCC 9080、S. cerevisiaeACCC 20065、S. cerevisiaeCICC 32919、S. uvarumCICC 31161、S. uvarumACCC 20202在無肌醇培養體系中（S2）均有明顯的同步生長，而S. uvarumCICC 1465在S2中未有明顯生長。因此，葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465為肌醇利用特異性菌株，具有特異性檢測肌醇含量的潛力。

2.2 肌醇測定菌株培養時間的選擇

圖2 S. uvarum CICC 1465菌株生長曲線（24～48 h）Fig. 2 Growth curve of S. uvarum CICC 1465 during cultivation period from 24 to 48 hours

由圖2可知，菌株S. uvarumCICC 1465在生長至38～48 h趨于穩定期，因而建議采用S. uvarumCICC 1465菌株進行肌醇測定時，在38～48 h進行監控，確定終點培養時間。

2.3 肌醇測定菌株標準曲線

實驗發現菌株S. uvarumCICC 1465生長OD550nm與培養體系中肌醇質量濃度呈S型曲線關系，四參數Logistic模型是S型曲線的常用擬合模型[30-31]，各參數對生物以應關系更具有實際意義，因此，本研究采用四參數Logistic擬合方式，以肌醇質量濃度為橫坐標，不同肌醇質量濃度下菌株生長OD550nm為縱坐標，進行標準曲線的擬合繪制。

圖3 S. uvarum CICC 1465肌醇測定標準曲線Fig. 3 Standard curve for determination of inositol using S. uvarum CICC 1465

由圖3可知，肌醇質量濃度0.1～0.2 μg/mL時，菌株OD550nm增長較為緩慢，肌醇質量濃度0.2～0.7 μg/mL時，菌株OD550nm呈對數增長，肌醇質量濃度0.7～1.0 μg/mL時，菌株OD550nm增長逐漸趨于平緩，曲線呈S型曲線以應關系，適宜于四參數Logistic模型。此外，本研究采用四參數Logistic擬合的標準曲線r2大于0.99，曲線擬合較好。

2.4 培養終點期菌株生長變化量

表1 S. uvarum CICC 1465在培養終點2 h內OD550 nm的變化Table 1 Change in OD550 nm of S. uvarum CICC 1465 within 2 h before the end point of culture

由表1可知，培養至終點時，2 h內菌株OD550nm的絕對差結果不大于5%。因此，建議培養約38 h后，同等條件下每隔2 h監測最高質量濃度標準曲線管S10，測定其OD550nm，兩次OD550nm的絕對差結果不大于5%時，終止培養，一般培養時間不超過44 h。

2.5 方法學驗證

2.5.1 精密度

表2 精密度測定結果Table 2 Results of precision test

表2結果表明，本方法在上述試樣的測定中，精密度均在10%以內，其中南瓜粉試樣的測定精密度均在2%以內。

2.5.2 回收率

表3 回收率測定結果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，本方法在不同基質中的回收率為92.3%～114.3%。

2.5.3 重現性

本實驗涉及維生素功能飲料、豬肝粉、南瓜粉及薏米粉4 種試樣，通過采用本研究方法分析同一試樣在不同驗證單位間的肌醇，考察本方法的重現性。表4結果顯示，本方法的重現性相對標準偏差均在10%以內。

表4 重現性測定結果Table 4 Results of reproducibility test

因此，綜合考察食品中肌醇測定方法的精密度、回收率及重現性，顯示篩選的測試菌株及測定方法在應用可行，能夠滿足測定要求。

3 討 論

3.1 接種菌懸液制備方式的優化

GB 5009.270—2016微生物法中，直接刮取麥芽浸粉瓊脂斜面培養基上的菌苔制備菌懸液。本研究將麥芽浸粉瓊脂斜面菌種轉接麥芽浸粉液體培養基后，再取培養物制備菌懸液。該操作避免了將瓊脂成分攜帶至菌懸液中，減少了對菌懸液透光率測定的干擾，從而保證了接種菌量的準確性。

3.2 測試菌株的優化

GB 5009.270—2016微生物法測定肌醇含量采用的測試菌株為釀酒酵母菌S. cerevisiaeATCC 9080。實驗過程發現，S. cerevisiaeATCC 9080在無肌醇培養體系中菌株仍可快速生長，缺乏對肌醇的生長特異性。因此，本研究通過菌株的肌醇利用特異性篩選實驗，篩選得肌醇生長特異性菌株葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465，經驗證，葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465符合方法的測定原理，且能夠滿足方法的測定要求。

3.3 終點判斷原則的優化

有關微生物法測定維生素含量的方法中，培養終點時間的判斷對測定結果準確度至關重要。若在終點前結束培養進行測定，那么高質量濃度培養體系中的肌醇未被微生物完全利用，從而導致測定結果無法以映試樣中肌醇的實際含量。因此，本研究通過監控肌醇最高濃度培養管的OD550nm變化，確定了培養的終點判斷原則，從而保證了測定方法的準確性及嚴謹性。

3.4 標準曲線擬合方式的優化

微生物法測定食品中維生素研究過程中發現，標準曲線常呈S型曲線，這使得傳統的線性擬合方式不能實現對標準曲線的良好擬合，而四參數Logistic模型是針對S型曲線實驗數據處理常用的方程。該模型符合生物學活性計算的前提和原則，操作簡便，普適性強，美國藥典（USP40）、歐洲藥典（EP9.0）、英國藥典（BP2017）均已收載四參數回歸計算法[32]。本研究將該模型用于微生物法測定食品中維生素含量中，經多次實驗驗證及比較，均表明該模型適用于本方法，且優于傳統的擬合方式，能夠滿足測定要求。

4 結 論

本研究成功篩選到1 株肌醇利用特異性菌株葡萄汁酵母S. uvarumCICC 1465，利用該菌進行食品中肌醇檢測方法研究，同時，將四參數Logistic擬合方式用于標準曲線的制作，并采用不同類別的試樣進行實驗室間方法學驗證，結果表明，本研究方法精密度、回收率及重現性均得到較好的效果。本研究改良了現行國家標準微生物法中的測試菌株，進一步明確并細化了方法中的相關操作步驟，規范了方法中的相關限制性原則及指標，使得方法的可操作性更強，保證了方法實施的嚴謹性，為相關食品安全監管部門及企業提供了更可靠的技術支撐。因此，本研究方法更適用于食品中肌醇的定量測定。