郫縣豆瓣自然與恒溫后熟發酵工藝對比分析

謝 思，趙曉燕，楊舒郁，劉 慶，吉 禮，劉 平，林洪斌，車振明，丁文武,

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.四川省食品生產安全協會，四川 成都 610056）

郫縣豆瓣屬中國傳統發酵食品，以其味辣香醇、黏稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點在我國醬類產品中獨樹一幟[1]，是川菜制作過程中不可或缺的一種調味品，因此對郫縣豆瓣進行相關研究具有非常重要的意義。對于郫縣豆瓣已進行的研究主要包括發酵過程中風味物質的形成以及影響因素[2-3]、后發酵過程中菌落變化和相關微生物分析[4-7]以及有害物質如黃曲霉毒素變化與關鍵控制點分析等[8]，然而對后熟發酵工藝的研究卻鮮有相關深入的探討。

目前郫縣豆瓣后熟發酵大多采用原始的傳統工藝進行生產，即成熟的甜瓣子與椒醅按一定比例混合后進入發酵池，經過充分的“日曬夜露”完成發酵，這也成為郫縣豆瓣發酵工藝的獨特之處，使其成為自身品質的保證。但此發酵方式缺陷也日益凸顯，如發酵周期較長，一般在6 個月至1 a以上，食品安全衛生控制難度大，機械自動化控制水平低，人工費用和生產成本高，生產規模難以擴大。隨著我國勞動力成本的增加和科技的飛速發展，工業生產已逐漸進入智能時代，因此，根據郫縣豆瓣傳統后熟發酵生產工藝的特點，設計新型現代化生產工藝和設備，提高自動化生產水平，促進該產業升級已成為郫縣豆瓣生產行業的迫切需求。

新型設備與生產工藝的設計離不開豆瓣發酵的基礎理論技術，絕大多數的傳統發酵食品采用固態發酵技術生產[9]，如醋、酒、郫縣豆瓣等，隨著人們對固態發酵技術的深入研究，國內外對其在食品工業中的應用也逐漸增多，如酶制劑[10-14]、有機酸[15-17]、食用菌[18]等，為實現固態發酵技術的多元化發展，滿足現代化生產需求，更多新型的工業化固態發酵以應器被開發出來，并且投入生產，這對郫縣豆瓣固態發酵以應器的設計具有重要的借鑒意義。

溫度是以應過程中極為重要的工藝條件，合適的溫度條件將加快以應速率，提高生產效率，因此，溫度選擇是工藝設計的一個重要部分，也是以應器設計的關鍵問題之一。恒溫以應不僅能夠實現穩態生產過程，使以應過程易操控，并且能避免能源的浪費，提高生產過程的經濟性；同時恒溫發酵工藝相對簡單，可避免傳統工藝發酵溫度過高或過低，影響微生物生長和酶的活性，從而出現發酵周期較長的問題，因此在對郫縣豆瓣后發酵工藝改進的探索中，恒溫成為工藝設計和選擇的首選控溫方式。

本研究設計并建立郫縣豆瓣的罐式發酵生產系統，并進行半封閉式恒溫后熟發酵實驗，同時與傳統自然后熟發酵進行對比分析，以期為郫縣豆瓣的現代化生產工藝設計和改進提供借鑒和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜瓣子與椒醅均購于四川郫縣豆瓣股份有限公司，購回后立即按一定比例混合，分別置于自然與恒溫發酵裝置中進行發酵。

氫氧化鈉、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖、甲醛、酚酞、乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、丙酮、三氯乙酸、鹽酸、17 種氨基酸標樣、茚三酮（均為分析純） 成都市科龍化工廠。

1.2 儀器與設備

30+氨基酸自動分析儀 英國Biochrom公司；SpectraMax i3x酶標儀 美國Molecular Devices LLC公司；磁力攪拌器 常州越新儀器制造有限公司；BS110S型電子天平 福州科錫儀器設備有限公司；7200可見光分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣自然與恒溫發酵工藝

圖1 郫縣豆瓣自然與恒溫后熟發酵裝置圖Fig. 1 Schematic illustration of natural and thermostatic post-fermentation systems for Pixian broad-bean paste

郫縣豆瓣發酵實驗裝置如圖1所示。整套裝置由空氣過濾裝置、自動控溫裝置、恒溫發酵裝置、測溫裝置、自然發酵裝置組成，自動控溫裝置為采用機械制冷降溫、電加熱升溫的液體循環設備，本次實驗中加入循環液體水對恒溫發酵裝置進行控溫；恒溫發酵裝置為50 L帶夾套的玻璃發酵罐，用紗布將封頭上的管口封住，形成半封閉的發酵環境；自然發酵裝置為豆瓣廠常用的曬缸；測溫裝置采用多路溫度巡檢儀對兩個不同發酵裝置里郫縣豆瓣的實時溫度進行測定。

在發酵罐與曬缸里都平均分布有上、中、下3 層，每層平均5 個測溫點，測溫裝置對每點每隔2 min進行一次溫度記錄，在整個發酵期間全程不間斷記錄。發酵開始時，將從工廠取回的成熟甜瓣子與成熟椒醅立即以質量比1∶3混勻后，分別置入自然發酵裝置與恒溫發酵裝置中進行發酵。自然發酵工藝采取傳統工藝“日曬夜露”模式，不進行人工控溫，每天早上8點攪拌一次；恒溫發酵工藝的發酵溫度為40 ℃，發酵過程中每隔3 d攪拌一次。2 種工藝發酵過程中，當豆瓣中的水分質量分數降至50%以下時進行適量補水，使其維持在50%～60%之間。取樣時，2 種發酵工藝均為攪拌后立即取樣，每隔6 d取樣一次，整個發酵時間為90 d。

1.3.2 溫度變化測定

自然發酵模式下，處理溫度數據時，隨著每天太陽的升起落下對曬缸日照方位的不斷變化，將曬缸分成左中右3 層，分別對應為日出面、正照面和日落面，再每隔3 d分別取日出面、正照面和日落面的最高溫度和最低溫度作圖；恒溫發酵模式下直接每隔3 d取數據作圖。

1.3.3 理化指標的測定

水分測定：采用GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[19]中直接干燥法；總酸與氨基酸態氮測定：采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》[20]中酸度計法；還原糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[21]；色價測定：采用GB 1886.34—2015《食品添加劑 辣椒紅》[22]中分光光度法；氨基酸測定：采用GB/T 30987—2014《植物中游離氨基酸的測定》[23]中全自動氨基酸分析儀法。

1.4 數據處理

采用Excel和Origin 8.5對實驗數據進行處理與分析以及相關圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 豆瓣發酵過程中溫度隨時間的變化

自然發酵模式下日出面、日落面和正照面各點分別為曬缸內中間層的兩端和中心3 個測溫點隨時間變化測得的數據值，以映容器內溫度隨時間變化的整體情況。本研究中，恒溫發酵采取40 ℃，主要根據微生物和酶的作用溫度以及前期自然發酵時測得的容器內能夠達到的最高溫度而設定。從圖2可以看出，恒溫發酵模式下，發酵容器內溫度沒有發生變化，說明發酵系統在發酵過程中性能穩定，能夠滿足郫縣豆瓣半封閉發酵的初步實驗；而自然發酵最高溫度和最低溫度均隨時間在不斷起伏變化并逐漸降低，且自然發酵日出面和日落面能達到的最高溫度均大于正照面，最低溫度均小于正照面，即端面的最高溫度均高于中心溫度，而最低溫度則低于中心溫度，說明缸體邊緣的溫度變化更為劇烈，而中心溫度相對穩定，這也為自然發酵工藝提供了溫度的多樣性，從而為微生物和酶的多樣性及其作用的發揮提供了有利條件，進而增加了郫縣豆瓣中營養物質和風味物質的豐富性，最終成為自然發酵的優勢。在自然發酵過程中，溫度在空間和時間上都為非穩態復雜分布，因而溫度對郫縣豆瓣自然發酵過程的影響極為復雜，將在后續研究中對此問題進一步深入討論。

圖2 2 種發酵模式下豆瓣溫度的變化Fig. 2 Changes in temperature of broad-bean paste in two post-fermentation modes

2.2 豆瓣發酵過程中水分的變化

圖3 2 種發酵模式下豆瓣水分質量分數的變化Fig. 3 Changes in moisture content of broad-bean paste in two post-fermentation modes

從圖3可知，2 種發酵豆瓣中的水分都隨著時間延長而逐漸降低，主要是由于隨著發酵時間的延長，發酵基質中的水分不斷向外界揮發所致，同時微生物利用發酵基質中的游離水進行生命活動也是導致豆瓣中水分不斷下降的可能原因之一；比較2 種工藝的水分變化可知，自然與恒溫發酵實驗結束時水分質量分數分別為48.80%、60.21%，自然發酵水分更容易散失，產品含量更低，這主要是由于自然發酵采取日曬夜露的開放式發酵，導致其水分比恒溫發酵更容易揮發到空氣中；發酵過程中，恒溫發酵的水分變化速率相對不變，而自然發酵則是先快后慢，主要是由于自然發酵易受環境溫度以及空氣濕度等因素的影響，發酵過程中，自然發酵前期溫度較高，局部溫度可達到50.0 ℃，而后期局部溫度最低只有6.0 ℃，而且后期溫度與水分的降低，抑制了微生物的生命活動，降低了水分的利用速率[24]，因而造成了自然發酵水分變化的復雜性。

2.3 豆瓣發酵過程中總酸隨時間的變化

在GB/T 20560—2006《地理標志產品 郫縣豆瓣》[25]中，合格的成品豆瓣總酸質量分數上限為2.00%，從圖4可看出，在整個發酵過程中自然與恒溫發酵總酸質量分數最高分別為1.15%、0.86%，均滿足產品標準。

圖4 2 種發酵模式下豆瓣總酸質量分數的變化Fig. 4 Changes in total acid content of broad-bean paste in two post-fermentation modes

2 種工藝條件下，發酵開始時總酸質量分數為0.64%，之后自然發酵的豆瓣醬醅總酸質量分數快速上升到第24天的1.02%，上升幅度為59.38%；恒溫發酵的豆瓣醬醅總酸質量分數上升到第30天的0.83%，上升幅度為29.69%，2 種工藝上升幅度均較大，為總酸質量分數快速增長的階段，Shukla等[26]認為在韓國豆醬發酵過程中乳酸菌等微生物作用可以產生有機酸，柴洋洋等[27]認為在豆醬發酵過程中酵母菌可以利用糖類產酸。本實驗中乳酸菌、酵母菌等微生物分解利用豆瓣中的碳水化合物、脂肪等，也可以產生乳酸、乙酸等小分子有機酸使總酸質量分數升高，并且降解蛋白質又會產生游離氨基酸使得總酸增加；同時自然發酵工藝下的總酸質量分數上升幅度明顯高于恒溫發酵，這可能是由于自然發酵下溫度變化復雜，一天中有高有低且持續時間都不長，導致可適應發酵條件的微生物種類和數量都更多，各種生化以應更劇烈，從而造成了總酸增長速率更快；隨后自然與恒溫發酵增長速率都減緩，這可能是由于在發酵后期，豆瓣中可被乳酸菌、酵母菌快速降解的成分含量下降，并且受環境等因素的影響，致使乳酸菌等的生長代謝變得緩慢甚至停止[28]，導致總酸增長速率減緩。有研究[29]發現在豆醬發酵過程中酵母菌與乳酸菌的代謝產物乳酸和乙醇會相互作用產生乳酸乙酯，這也是郫縣豆瓣發酵后期總酸變化趨緩的原因之一，即豆瓣中的酵母菌產生的醇類物質也會與酸結合形成中性的酯類。

2.4 豆瓣發酵過程中氨基酸態氮隨時間的變化

由圖5可知，2 種發酵模式下，發酵開始時氨基酸態氮質量分數為0.14%，發酵結束時自然發酵氨基酸態氮質量分數為0.27%，上升幅度92.86%，恒溫發酵為0.20%，上升幅度42.86%，自然發酵上升幅度約為恒溫發酵的2 倍，增長速率更快，這與總酸情況類似，可能和自然發酵溫度有關，并且水分差異也是影響上升幅度的因素之一。

圖5 2 種發酵模式下豆瓣氨基酸態氮質量分數的變化Fig. 5 Changes in amino nitrogen content of broad-bean paste in two post-fermentation modes

自然發酵下氨基酸態氮變化趨勢呈現先上升后趨于平緩，這與貢漢坤[30]對豆醬自然發酵過程中氨基態氮變化趨勢研究結果一致，這是由于在開始階段溫度有高有低，溫度較高時蛋白酶活力較好，溫度較低時能促進微生物的生長代謝以及蛋白酶的產生，從而有利于促進蛋白質水解，進而使得氨基酸態氮增長速度較快，隨著發酵的進行，溫度的降低以及各種成分的積累使微生物分泌的蛋白酶減少并且蛋白酶活力降低，從而使得氨基酸態氮增速變緩[31]。

恒溫發酵模式下，氨基酸態氮質量分數先基本不變后快速增加，這可能是恒溫發酵前期溫度較高，導致適應高溫發酵的微生物數量減少，進而使得微生物分泌的蛋白酶減少，造成與原物料中所帶入的蛋白酶含量之和不高，使得產物的生成與微生物生長繁殖對氨基酸態氮的消耗達到一種平衡[32]，最終導致發酵前期氨基酸態氮的含量幾乎不變，隨著發酵時間的推移，適應高溫發酵的微生物數量增加，其分泌的蛋白酶含量也增加，進而加快了蛋白質水解生成氨基酸態氮速率，因而出現氨基酸態氮快速增長的現象。

通過以上對比分析可以看出，氨基酸態氮在2 種發酵模式下的變化趨勢并不相同，且微生物可能是促進氨基酸態氮生成的一個不可忽略的因素，而自然發酵溫度的時空多維分布則是造成微生物變化的重要因素。

2.5 豆瓣發酵過程中還原糖隨時間的變化

圖6 2 種發酵模式下豆瓣還原糖質量分數的變化Fig. 6 Changes in reducing sugar content of broad-bean paste in two post-fermentation modes

由圖6可知，發酵開始時還原糖質量分數為2.16%，自然發酵條件下，到36 d還原糖質量分數上升至最大值3.42%，為初始含量的1.58 倍，隨后開始下降，直至發酵結束還原糖質量分數下降到2.81%，為最大值的82.16%；恒溫發酵條件下，到36 d還原糖質量分數上升至最大值2.36%，為初始值的1.09 倍，隨后開始下降，直至發酵結束還原糖質量分數下降到2.12%，為最大值的89.83%。由以上數據可知發酵初期2 種模式下的還原糖質量分數都呈上升趨勢，這可能是因為霉菌產生的淀粉酶和糖化酶將原料中的淀粉快速水解產生還原糖，水解生成還原糖的速率遠大于還原糖的利用速率，使得還原糖總量快速增加；隨后還原糖質量分數都逐漸下降，一方面是由于還原糖被豆瓣中的微生物快速利用和消耗，為微生物的生長提供碳源，發酵產生乳酸、乙酸等小分子有機酸[28]，另一方面，還原糖還參與諸如美拉德以應等多種化學以應生成其他物質，并且累積到一定程度的還原糖對淀粉酶生成有抑制作用[33]，最終導致還原糖質量分數下降。

同時，自然發酵下還原糖質量分數上升幅度與下降幅度均大于恒溫發酵，因為還原糖與微生物的生長相關，還原糖質量分數變化幅度越大，微生物生命活動越強烈，所以自然發酵下的各種生化以應更加強烈，這也從另一方面印證了此次實驗中總酸、氨基態氮等由于自然發酵下各種生化以應更加強烈導致其變化量更大的實驗結論。

2.6 豆瓣發酵過程中色價的變化

圖7 2 種發酵模式下豆瓣色價的變化Fig. 7 Changes in chromaticity of broad-bean paste in two post-fermentation modes

由圖7可知，2 種發酵模式下，豆瓣色價都隨時間延長逐漸下降，這是因為辣椒紅色素在存放過程中，極易受到溫度、光照以及油脂中的水分和金屬離子等的作用，從而發生復雜的化學以應被破壞，導致色價損失[34]。2 種工藝相比，自然發酵下色價下降更快，實驗結束時，自然與恒溫發酵色價分別為0.784、1.025，兩者差異較大，由前面分析可知，自然發酵模式下溫度、水分變化量均較大，相比于恒溫發酵半封閉式的發酵罐受到的光照也更強烈，從而導致色價損失較多。由于顏色的變化是能直接以映豆瓣品質的一項重要指標，色價越高，顏色越油潤有光澤[35]，產品質量越好，因此保護色價是郫縣豆瓣的一個重要研究方向，通過對比2 種后熟發酵工藝可知，恒溫發酵更有利于保持郫縣豆瓣的色價。

2.7 豆瓣發酵過程中游離氨基酸隨時間的變化

表1 豆瓣自然發酵過程中游離氨基酸的組成與含量Table 1 Change in free amino acid composition of broad-bean paste during natural post-fermentation

表2 豆瓣恒溫發酵過程中游離氨基酸的組成與含量Table 2 Change in free amino acid composition of broad-bean paste during thermostatic post-fermentation

由表1、2可知，在2 種發酵工藝下，17 種氨基酸含量均在發酵結束時達到最大值，說明氨基酸的生成是一個累積增多的過程，這是由于在豆瓣的后熟過程中，一部分蛋白質在酶的催化作用下水解為低分子肽類和氨基酸使得氨基酸含量增加[36]；自然發酵過程中氨基酸總量呈先快速上升后趨于平緩趨勢，恒溫發酵過程中氨基酸總量呈不斷緩慢上升趨勢，到發酵結束時自然發酵下每種氨基酸含量的最大值均高于恒溫發酵，其中最高含量的谷氨酸在自然與恒溫發酵中分別為3.304、2.539 mg/g，最低含量的胱氨酸分別為0.014、0.006 mg/g，這與氨基態氮生成情況類似，都是由于自然發酵條件下溫度的不斷變化造成曬缸內各種生化以應更加劇烈，從而導致氨基酸含量增加更快。武俊瑞等[37]研究發現豆醬在自然發酵過程中組氨酸僅在發酵45 d有檢出，含量為0.07 mg/g，精氨酸只在發酵0～55 d有檢出，平均值為0.29 mg/g，說明豆醬在發酵生成氨基酸的過程中某些氨基酸只在一段時間里產生，且含量較低，在本實驗中也出現了類似結果，胱氨酸只在自然發酵中的75～90 d有檢出，僅在恒溫發酵中的45 d與90 d有檢出，說明胱氨酸的生成主要在后熟發酵的中后期，同時恒溫發酵比自然發酵提前了30 d檢出胱氨酸，恒溫發酵能更早生成胱氨酸，由于氨基酸的積累可以促進生成郫縣豆瓣特殊的香味物質從而提高產品質量，并且郫縣豆瓣特殊的滋味是由多種呈味氨基酸的協同作用形成的，每一種氨基酸都有其不可或缺的作用，因此豆瓣形成完整的特殊風味恒溫發酵比自然發酵所用時間可能會更短。

根據Tseng等[38]對氨基酸滋味的描述，將其分為鮮味、甜味、苦味和無味，由表1、2可知，在2 種工藝發酵過程中，4 類氨基酸之間的比例都基本保持不變，這與趙建新[28]對豆醬氨基酸研究結果一致，并且都是苦味氨基酸所占比例最高，依次降低分別為鮮味、甜味和無味，同時自然與恒溫發酵工藝間4 類氨基酸所占比例也基本相同，并沒有被溫度等其他因素影響而產生差異，推測這是由于蠶豆蛋白中各種氨基酸含量決定的。

3 結 論

本研究設計了一套郫縣豆瓣半封閉發酵系統，并利用該系統進行為期90 d的郫縣豆瓣后熟恒溫發酵實驗，由實驗結果可知半封閉式系統的溫度保持40 ℃不變，發酵系統在發酵過程中性能穩定，能夠滿足郫縣豆瓣罐式發酵的初步實驗。

發酵實驗結束時自然與恒溫發酵總酸質量分數分別為1.13%與0.78%，氨基酸態氮質量分數分別為0.27%與0.20%，還原糖質量分數分別為2.81%與2.12%，游離氨基酸含量分別為19.68 mg/g與16.11 mg/g，水分質量分數分別為48.80%與60.21%，色價分別為0.784與1.025。結果表明，自然發酵模式下的總酸、氨基態氮、還原糖和游離氨基酸的最終含量均比恒溫發酵高，水分質量分數和色價均比恒溫發酵低，自然發酵下各種物理和生化以應進行的更加劇烈，而溫度的時空多維分布和水分質量分數的變化則有可能是造成其差異的主要原因。

通過對比分析可知，自然發酵和恒溫發酵都可以正常發酵，發酵產品也都符合國家相關產品質量標準，2 種工藝也各有優勢，然而自然發酵的指標多數優于恒溫發酵，究其原因為自然發酵雖然發酵手段原始，但這種落后的發酵工藝也為發酵過程提供了溫度、水分、溶氧等復雜多樣的工藝條件，進而為產品質量的提高提供了更大的可能性，因此，在本實驗基礎上分析自然發酵的影響因素，對進一步改進恒溫發酵工藝具有非常重要的意義，這也是今后即將進行的一個重要工作。