基于電子舌與SPME-GC-MS技術檢測腐乳風味物質

樊 艷，李浩麗，郝怡寧

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

腐乳是一種微生物發酵大豆制品[1]，按其色澤可以分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳和各種花色腐乳，其中紅腐乳因其色澤鮮艷、口感醇厚和氣味愉悅，深受消費者喜愛。腐乳的滋味和香氣是衡量其質量的重要指標之一，對腐乳的風味物質展開研究，不僅能夠指導其加工工藝的優化，還有助于提高產品質量，進而提升其被消費的接受度。

滋味物質大多是水溶性、非揮發性的化合物[2]，電子舌是近年發展起來的一種用于分析滋味物質的新型檢測手段[3-4]，目前使用電子舌研究腐乳滋味的報道較少。揮發性組分研究的前處理方法主要有液液萃取、同時蒸餾萃取[5-6]、頂空吸附等[7]。固相微萃取（solid-phase microextractio，SPME）是一種無溶劑樣品前處理技術，操作簡單、用時短[8]，被廣泛應用于風味物質的研究，但鮮見應用于腐乳揮發性組分研究的報道。SPME和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯用在揮發性物質的分析和未知化合物的鑒定方面有非常理想的效果[9]。

本研究以自制霉腐乳和市購腐乳為研究對象，采用電子舌結合氨基酸自動分析儀比較腐乳樣本的整體滋味和主要呈味物質的異同；采用SPME提取揮發性組分，同時對萃取頭進行比較選擇，利用GC-MS結合保留指數（retention index，RI），對樣本中的揮發性組分進行定性和定量以及風味物質的分析和比較，為霉腐乳的研發和生產提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種腐乳樣本：2 種為毛豆腐制得的霉豆腐乳，編號為M1（腐乳毛霉菌種），M2（菌種同M1）；2 種為市購紅方腐乳，編號分別為C1（氨基氮質量分數為1.120%）、C2（氨基氮質量分數為0.921%）。

10%三氯乙酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；500 mg/L正構烷烴（C7～C40）混合標準品 美國o2si公司；正己烷（色譜純） 德國CNW公司；H型氨基酸混合標準品、茚三酮試劑以應液 日本和光純藥工業株式會社；氨基酸分析用緩沖液 日本三菱化學株式會社；去離子水（色譜級）由美國Millipore純水機制備。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠；GL-6250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Avanti J-26XP離心機 美國貝克曼公司；ASTREE電子舌（包含ASH、CTS、ANS、NMS、SCS、PKS和CPS 7 個味覺傳感器和1 個Ag/AgCl參比電極） 法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；MPS XT多功能樣品處理平臺 德國Gerstel公司；L-8900型氨基酸分析儀 日本株式會社日立制作所；SPME萃取頭類型見表1，購自美國Supelco公司。

表1 SPME萃取頭類型Table 1 SPME fibers used in this study

1.3 方法

1.3.1 霉腐乳樣品的制作

2 000 g老豆腐，切成4 cm×4 cm×1.5 cm小方塊，上鍋蒸5min后放置涼透。稱取15 g毛霉菌菌粉，加入500 mL水，攪拌均勻，把切好的豆腐塊以1 cm均勻間隔擺放在蒸鍋上，噴灑配制好的菌液，鍋底加水，蓋好蓋子，溫度15～25 ℃，相對濕度不低于50%，1 d開始長毛，發酵3 d后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。稱取1 000 g毛豆腐，晾干，蘸取40 g的52°白酒，包裹50 g鹽、15 g辣椒粉和1.6 g花椒粉[11]，入瓶，于陰涼處避光密封儲存一周即可食用，存儲后期M1樣品添加食用油封面，M2未用油封面。

1.3.2 腐乳滋味的電子舌檢測

4 個腐乳樣本，每個樣本3 組平行，每組平行樣稱5 g（精確到0.01 g），加50 mL水攪拌并超聲20 min，10 000 r/min離心20 min，過濾，濾液倒入電子舌樣品杯中，和洗液（超純水）間隔放在樣品盤上，采集頻率為120 s/次，每個樣重復檢測6 次，取后3 次穩定的檢測數據進行分析（傳感器響應值會有一定程度波動[12]）。

1.3.3 游離氨基酸的檢測

樣本冷凍干燥后，研磨成粉，稱取0.2 g（精確到0.001 g）于試管中，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，沉淀樣本中多肽和蛋白質，搖勻后存于4 ℃環境中，每隔10 min搖勻1 次，2 h后取出，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋2 倍后，上全自動氨基酸分析儀測試。

1.3.4 腐乳氣味的SPME-GC-MS檢測

SPME條件[13]：精確稱取3 g樣品于20 mL頂空瓶中，MPS保溫箱溫度60 ℃，平衡時間10 min，萃取時間30 min，解吸時間300 s，萃取頭老化溫度260 ℃，老化時間30 min。

GC條件[13-14]：DB-5 MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；升溫程序：柱溫35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升溫到80 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫到200 ℃，保持20 min。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；采集模式為全掃描（Scan）；質量掃描范圍30～450 u。

RI測定：取正構烷烴混合標準品，稀釋100 倍，按GC-MS條件進行分析，進樣量1 μL，分流比10∶1，溶劑延遲時間5 min，樣品中各揮發性組分的RI根據式（1）[15]計算：

式中：tx為待測組分的保留時間/min；tn為碳原子數為n的正烷烴（tn＜tx）保留時間/min；tn+1為碳原子為n+1的正烷烴（tx＜tn+1）保留時間/min。

定性和定量：匹配度不小于90，按烷烴標準品數據信息計算RI[16-17]，并與其他文獻測定的RI進行對比確認，對樣品的揮發性組分進行定性；采用峰面積歸一化法進行定量，計算得到各組分的相對含量。選擇揮發性組分的總峰面積和峰數量為考察指標，比較不同萃取頭對樣品揮發性組分萃取效果的影響。

1.3.5 PCA和TAV分析

判別指數（discrimination index，DI）為進行主成分分析（principal component analysis，PCA）時樣品區分程度的表征值，當DI在80%～100%時說明區分有效[18]。采用滋味活性值（taste active value，TAV）評價組分對滋味的貢獻度，TAV以映了各呈味化合物對樣品滋味的貢獻程度，在評價單個組分對整體風味的貢獻時，TAV是最經典、客觀的方法[19]，其值按式（2）計算[20]。當TAV＜1時，該組分對整體滋味貢獻不明顯，當TAV≥1時，該組分具有滋味活性，可能對樣本整體滋味具有顯著性貢獻，且值越高，貢獻越大[21]。

1.4 數據處理

采用Excel 2007和Origin pro 2018C軟件制表和繪圖，采用Origin pro 2018C軟件進行PCA和聚類分析，采用MSD ChemStation軟件處理SPME-GC-MS數據，未知揮發性組分與NIST08.L標準譜庫進行匹配。

2 結果與分析

2.1 電子舌檢測及傳感器響應值的分析

如圖1所示，自制的霉腐乳（M1）和市購2 種腐乳（C1、C2）口感較為接近，發酵后期的霉腐乳（M2）的苦、酸味值都遠高于其他3 種腐乳，原因為在貯存后期未添加食用油封面，離開汁液的腐乳暴露在空氣中逐漸褐變造成的。

圖1 腐乳電子舌傳感器響應雷達圖Fig. 1 Radar diagram of electronic tongue sensor responses to fermented bean curd

圖2 基于電子舌的腐乳PCAFig. 2 Principal components analysis score plot of fermented bean curd based on electronic tongue sensor responses

由圖2可知，PC1和PC2對總體方差的累計貢獻率達到了99.97%，滿足大于85%的界限[22]，說明PC1和PC2幾乎包含了樣本的所有信息，可以以映出腐乳的整體滋味信息，其中PC1的方差貢獻率遠高于PC2，說明腐乳滋味在PC1上差距比PC2大[23]。DI值為98%，表明4 個腐乳樣本差異明顯，能夠用電子舌較好地區分，后期發酵霉腐乳（M2）和另外3 種腐乳相距很遠，與圖1結果相似。

2.2 腐乳中的游離氨基酸組成

腐乳中的游離氨基酸主要是在其發酵過程中由蛋白質分解產生的[24]，不同的氨基酸組成和含量賦予腐乳豐富的味覺層次，使其具有鮮美、醇和、濃郁、柔潤的滋味特征[25]。按游離氨基酸的呈味特征[26-27]，將17 種游離氨基酸分為鮮、甜、苦味3 組。如表2所示，4 種腐乳樣本中含有豐富的游離氨基酸，在檢測的17 種氨基酸中，除了Cys在C1和C2中未檢測到，其余氨基酸在4 個樣本中均有被檢出。有研究[28]表明，Glu（鮮味）、Asp（鮮味）、Ala（甜味）、Met（苦味）和Lys（苦味）是發酵豆制品中主要的游離氨基酸。M1中游離氨基酸總量最大，鮮味氨基酸含量最大，對滋味貢獻大的氨基酸依次為Glu、Val、Ala、His、Lys、Pro、Phe、Ile、Asp和Leu；M2中苦味氨基酸含量最大，該結論與電子舌分析結果一致，但苦味氨基酸含量過高會帶來不良風味，影響腐乳整體口感，對滋味貢獻大的氨基酸依次為Glu、Lys、Val、Ala、Ile、Phe、Tyr、Met、Asp、Leu、Gly、His和Arg；C1中游離氨基酸總量最小，可能是腐乳配方中的某些環境因素降低了蛋白酶系的活力，導致蛋白質分解成短肽和氨基酸的能力下降，鮮味氨基酸含量最大，對滋味貢獻大的氨基酸只有Glu；C2中苦味氨基酸含量最大，對滋味貢獻大的氨基酸依次為Glu、Val、Ala、Tyr、Lys、Phe、Met、His、Asp、Ile、Leu、Ser、Pro和Gly，與M2相似，但TAV相對較小。4 種腐乳中對滋味貢獻最大的氨基酸均為Glu，Yamaguchi等[29]研究Glu是類似味精的鮮味物質，與其鈉鹽提供鮮味，因此4 種腐乳獨特的滋味和鮮味氨基酸組分有一定關系。

2.3 SPME-GC-MS揮發性成分的分析

2.3.1 萃取頭對萃取效果的影響

不同萃取頭涂層的極性不同導致其吸附的組分種類和極性不同[32-33]。由圖3可知，不同萃取頭對腐乳的萃取效果存在顯著差異，其50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭得到的組分的總峰面積和峰數量都是最大的，因此，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭用于腐乳揮發性組分的測定分析。

圖3 萃取頭類型對腐乳揮發性組分萃取效果的影響Fig. 3 Effect of extraction fibers on the extraction efficiency of volatile compounds from fermented bean curd

2.3.2 腐乳揮發性組分的分析

經GC-MS檢測，發現4 種腐乳揮發性組分復雜，本研究所采用的分析條件能較好地分離這些組分。按NIST08.L標準庫檢索，結合RI對腐乳中的揮發性組分進行的鑒定，結果見表3。4 種腐乳共鑒定出73 種揮發性組分，其中M1共鑒定出38 種，萜烯類占53.06%、芳香族占20.68%、醇類占9.00%、酯類占4.99%、烷烴類占4.11%、含氮化合物占2.53%、烯烴類占1.92%、酮類占1.60%、萘類占0.46%；M2鑒定出31 種，芳香族占55.72%、萜烯類占24.07%、烷烴類占7.51%、醚類占4.95%、醇類占3.89%、酯類占1.96%、烯烴類占1.05%、萘類占0.84%；C1共鑒定出27 種，醇類占59.19%、芳香族占25.17%、酯類占13.79%、萜烯類占1.40%、萘類占0.41%、烷烴類占0.04%；C2共鑒定出14 種，醇類占59.45%、酯類占40.40%、芳香族占0.12%、烷烴類占0.02%。M1中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高，M2中芳香族和萜烯類化合物的相對含量較高；C1中醇類和芳香族化合物的相對含量較高，C2中醇類和酯類化合物的相對含量較高。

表2 腐乳中游離氨基酸組成和含量及其對應的TAVTable 2 Contents of free amino acids in fermented bean curd and their TAVs

表3 4 種腐乳揮發性組分的分析結果Table 3 Analysis of volatile compounds in four fermented bean curds

續表3

腐乳發酵過程中，氨基酸和湯料中的乙醇發生一系列復雜的生化以應產生酯類、醇類和醛類等揮發性風味物質[35-36]。小分子質量的酯類物質具有獨特的氣味，如水楊酸甲酯（M1相對含量2.48%）、癸酸乙酯（M1相對含量0.15%、C1相對含量0.67%、C2相對含量0.05%）、3-苯丙酸乙酯（C2相對含量0.03%）有水果味及其他誘人的風味；大分子質量的酯類雖然氣味閾值高，香味弱，但含量高也可以產生特有的風味，如棕櫚酸乙酯（C1相對含量8.75%、C2相對含量21.34%）有微弱果爵和奶油香味，9-十八酸乙酯（C2含7.80%）有淡淡的花味[37]。M1中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高，有可能是加入香辛料的原因，其中3-蒈烯的相對含量為43.45%，3-蒈烯多用于食用香精的配方[38]，M2中的3-蒈烯的相對含量也超過了10%，M1和M2中萜烯類化合物相對含量均高于C1和C2的萜烯類化合物含量，一定程度上說明M1和M2在生產中使用的香辛料用量大于C1和C2的香辛料用量。具有茴香特殊香氣[39]的茴香腦在M1、M2和C1中均被檢測到，相對含量分別為11.81%、44.91%和22.15%。具有玫瑰香氣的苯乙醇在M1中的相對含量為7.95%。C1和C2中乙醇的相對含量都超過了50%，酒香明顯，應該是蛋白質等物質在發酵過程中分解產生的醇類物質增加[39-40]，這與王倫興等[41]的研究結果一致。劉娜等[42]采用頂空SPME-GC-MS-嗅聞法測定紅腐乳揮發性風味物質，結果表明乙醇和酯類化合物是其主要貢獻成分。穆旻等[5]對紅腐乳中揮發性成分的提取和分析鑒定出的76 種揮發性成分中酯類有30 種、醇類10 種，與本實驗測得的C1和C2的結果一致，2 種樣品中醇類和酯類占比不同，可能與2 種紅腐乳的生產工藝條件差異相關。M1和M2中烷烯類物質可能是脂肪分解產生的[6]，但由于其風味閾值較高，故對腐乳的總體風味貢獻不大。

2.3.3 PCA結果

運用Origin pro 2018C軟件對4 種腐乳樣本揮發性成分的相對含量進行PCA，由結果可知，PC1貢獻率為48.65%，PC2貢獻率為42.75%，PC3貢獻率為6.56%，PC4貢獻率為2.04%，累計貢獻率為100%。如圖4所示，4 種腐乳中M1和M2分布在第2象限，與其相關性較高的揮發性組分是G10（3-蒈烯）和G9（1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯）；C1和C2分布在第1象限，與其相關性較高的揮發性組分為G67（棕櫚酸乙酯）、G1（乙醇）和G20（茴香腦）。

圖4 4 種腐乳的主成分雙標圖Fig. 4 PCA score plots and loading plots of four fermented bean curds

2.3.4 聚類分析結果

圖5 4 種腐乳的聚類分析樹狀圖Fig. 5 Clustering dendrograms of four fermented bean curds

由圖5可知，當4 種腐乳在類間間距為40時，腐乳樣本分為2 類，第1類為M1和M2，第2類為C1和C2；當類間間距為30時，腐乳樣本分為3 類，第1類為M1，第2類為M2，第3類為C1和C2。聚類分析結果和GC-MS檢測結果一致。

3 結 論

本實驗采用電子舌和SPME-GC-MS結合化學計量學方法對4 種不同品牌腐乳的滋味和揮發性組分進行研究，比較自制霉腐乳和市售腐乳在滋味和風味上的異同。結果表明，電子舌傳感器響應雷達圖和PCA圖能看出4 個腐乳樣本差異明顯，能夠用電子舌較好地區分，自制霉腐乳（M1、M2）的滋味特征有別于其他2 種；氨基酸分析結果表明4 種腐乳樣本中Glu的TAV最大，自制霉腐乳M1中鮮味氨基酸含量最大，M2中苦味氨基酸含量最大，此結果和電子舌分析結果一致；SPME-GC-MS共鑒定出73 種揮發性組分，其中酯類、醇類、萜烯類和芳香族類化合物相對含量較高，是構成腐乳香氣的主要成分，自制霉腐乳中萜烯類和芳香族化合物的相對含量較高。利用PCA法得到的雙標圖中可知自制霉腐乳M1和M2分布在同一象限，與其相關性較高的揮發性組分為3-蒈烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環己二烯；利用聚類分析能看出不同腐乳之間的親疏遠近，其中自制霉腐乳M1和M2的揮發性成分最為接近。本研究結果為霉腐乳的研發和生產提供基礎性數據，3 種研究方法互為輔助，結合使用會使結果更全面、可靠。