NALP3炎性體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白在退變腰椎間盤髓核組織中的表達(dá)及意義

鄧劍鋒,李廣章,劉 然,齊穎釗,劉志新

(秦皇島市第一醫(yī)院 骨三科,河北 秦皇島066000)

腰椎間盤突出癥是脊柱外科最常見的病癥之一，腰椎間盤退變是引起腰椎間盤突出癥的病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為纖維環(huán)原與髓核之間清晰界限消失，凝膠樣髓核消失[1,2]。有學(xué)者研究表示，腰椎間盤退變由營養(yǎng)、遺傳、免疫、力學(xué)等多種因素共同造成，力學(xué)因素最為直接，直接作用于人們的直立行走[3]。腰椎間盤在行走過程中容易受到損傷，導(dǎo)致機(jī)體炎性因子和免疫反應(yīng)被激活，使細(xì)胞核收到退變信號，影響椎間盤關(guān)鍵組分的合成和講解以及核內(nèi)基因表達(dá)。有學(xué)者研究中表示，椎間盤退變的發(fā)展和發(fā)生中細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成，細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝失衡起著重要作用[4]。本文研究核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NALP3炎性體)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2在退變腰椎間盤髓核組織中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象：在我院選取2017年6-2018年6月接受治療的80例腰椎間盤突出癥患者，男性41例，女性39例，年齡21-54歲，平均年齡(36.5±13.6)歲；病程1-6，平均病程(4.3±1.5)年。腰椎間盤突出癥患者椎間盤退變使用Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行MRI分級，Ⅱ級患者16例，具有輕度退變，輕微降低加權(quán)信號強(qiáng)度；Ⅲ級29例，中度退變，中度降低加權(quán)信號強(qiáng)度；Ⅳ級21例，嚴(yán)重退變，明顯降低加權(quán)信號強(qiáng)度；Ⅴ級14例，嚴(yán)重退變，嚴(yán)重降低加權(quán)信號強(qiáng)度。另外選取在我院行前路減壓內(nèi)固定切除的脊柱骨折患者椎間盤為正常椎間盤髓組織，男性45例，女性35例，年齡22-51歲，平均年齡(35.6±11.2)歲，兩組患者一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：腰椎間盤突出癥患者具有臨床典型癥狀、體征，經(jīng)過X線檢查患者椎間隙明顯下降，MRI顯示腰椎間盤突出，TW2髓核信號降低。所有患者及其家屬對本文研究均知情，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病者及感染性疾病者；排除合并腫瘤者；排除凝血功能異常者，排除精神疾病者，排除嚴(yán)重心腎肺功能不完全者。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本制作 將所有腰椎間盤突出癥患者進(jìn)行手術(shù)切除，取出在纖維環(huán)內(nèi)的椎間盤髓核組織。另外選取在我院行前路減壓內(nèi)固定切除的青壯男脊柱骨折患者椎間盤為正常椎間盤髓組織。隨機(jī)取出0.5 cm2大小的退變椎間盤髓核組織塊，并行常規(guī)石蠟包埋，厚度為3 cm，在0-4℃的冰箱內(nèi)保存。連續(xù)切片作免疫組化標(biāo)記。

1.2.2免疫組化染色 將待測標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化后，浸泡在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中，并進(jìn)行熱修復(fù)，培育在3%的H2O2的環(huán)境下，在山羊血清中滴入10 min后進(jìn)行封閉，在25-27℃的環(huán)境下孵育0.5 h，然后抽離封閉液，將一抗加入，培養(yǎng)在5℃的環(huán)境中過夜，第2天加入而抗，并培養(yǎng)在37℃的恒溫箱中0.5 h，使用PBS淋液沖洗后進(jìn)行DAB顯示、脫水、封片處理。

1.2.3NALP3炎性體檢測 使用Western Blot檢測，將PBS緩沖液清洗標(biāo)本3次進(jìn)行分離緩沖液裂解0.5 h，對蛋白濃度進(jìn)行測定。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，在電泳10 min后加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液，將電轉(zhuǎn)膜在10%的牛奶中浸泡，封閉在常溫1.5 h的搖床上；使用TBST與一抗結(jié)合之后進(jìn)行稀釋，并孵育、保存；第2天使用TBST液進(jìn)行清洗，與二抗結(jié)合后常溫孵育1 h，再清洗，加入顯影劑顯色，對NALP3炎性體水平進(jìn)行測定。

1.2.4BMP-2標(biāo)本檢測 檢測BMP-2水平使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，緩沖液稀釋50 mM碳酸鹽包BMP-2抗原，之后添加到聚苯乙烯的反應(yīng)板孔中，放置24 h溫度4 ℃，次日洗滌劑洗滌3次后，拋干。在各孔中加入稀釋液稀釋的待測標(biāo)本0.1 ml，同時(shí)加入陽性和陰性的對照標(biāo)本，42 ℃放置60 min，將液體移除洗滌3次后，拋干。在各孔中加入BMP-2的酶標(biāo)抗體0.1 ml，43 ℃放置60 min。液體移去，洗滌3次，拋干。在各個空中加入0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸滴液混勻,再加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光處理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 ml，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測405，分析BMP-2水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象NALP3、BMP-2表達(dá)比較

如表1、圖1、圖2所示，腰椎間盤組患者NALP3、BMP-2表達(dá)與正常組NALP3、BMP相對表達(dá)水平相比，腰椎間盤組患者NALP3表達(dá)升高，BMP-2表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 兩組研究對象NALP3、BMP表達(dá)比較

圖1 NALP3、BMP-2在退變椎間盤髓核組織中的表達(dá)免疫組化染色圖(×200)

圖2 NALP3、BMP-2在正常椎間盤髓核組織中的表達(dá)免疫組化染色圖(×200)

2.2 NALP3、BMP-2與退變等級的關(guān)系

如表2所示，與Ⅱ級相比，Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與Ⅲ級相比，Ⅳ級、Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與Ⅳ級相比，Ⅴ級患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 NALP3、BMP-2與退變等級中的關(guān)系

注：與Ⅱ級比較，aP<0.05；與Ⅲ級比較，bP<0.05；與Ⅳ級比較，cP<0.05。

2.3 NALP3、BMP-2與患者腰部負(fù)荷嚴(yán)重程度的關(guān)系

如表3所示，與很輕程度相比，輕、中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與輕程度相比，中、重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與中程度相比，重程度患者NALP3水平升高，BMP-2水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 NALP3、BMP-2與患者腰部負(fù)荷嚴(yán)重程度

注：與很輕程度比較，aP<0.05；與中程度比較，bP<0.05；與重程度比較，cP<0.05。

2.4 NALP3、BMP-2之間相關(guān)性分析

NALP3、BMP-2之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，NALP3、BMP-2之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.269，P=0.016)。

3 討論

腰椎間盤細(xì)胞受外界因素影響，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)分子水平變化，從而使細(xì)胞生物學(xué)行為變化[5]。研究證明，細(xì)胞外基質(zhì)成分合成減少、分解增加也是造成腰椎間盤退變的主要因素，腰椎間盤退變是引起腰椎間盤突出的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重將導(dǎo)致腰腿痛[6]。腰椎間盤髓核細(xì)胞衰老是造成腰椎間盤退變的重要原因，是由炎性因子刺激、細(xì)胞能力代謝障礙等導(dǎo)致。細(xì)胞能量代謝障礙是腰椎間盤突出癥患者椎間盤退變的重要機(jī)制，一方面營養(yǎng)物質(zhì)彌散障礙是軟骨終板老化所致，一方面線粒體變形、線粒體內(nèi)滲透壓改變、炎性因子對線粒體的干擾是由力學(xué)因素所致且對細(xì)胞的能量代謝造成影響[7]。

NALP3炎性體是一種胞內(nèi)模式識別受體，在激發(fā)免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)中具有調(diào)控作用[8]。研究顯示，一系列不同的內(nèi)源性和外源性因素對NALP3炎性體刺激后，可以將依賴在半胱氨酸激酶的活性激活[9]。炎性半胱天冬酶-1在鉀內(nèi)流、活性氧及溶酶體等因素的作用下被激活，從而使NALP3炎性體發(fā)生募集組裝，以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞黏附、滲透，使機(jī)體局部炎癥發(fā)生[10]。研究中顯示，NALP3炎性體在治療的靶點(diǎn)具有一定應(yīng)用價(jià)值，腰椎間盤突出癥患者退變腰椎間盤髓核衰老以后NALP3炎性體表達(dá)越高，腰椎間盤突出癥患者疼痛感癥狀越重[11,12]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為多功能生長因子，是轉(zhuǎn)化生長-β超家族的一員，屬于在骨和骨髓中提取的特殊蛋白質(zhì)，具有一定的誘導(dǎo)作用[13,14]。在腰椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展中細(xì)胞外基質(zhì)合成和分解代謝失衡具有重要作用[15,16]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白還是一種多效的形態(tài)發(fā)生素，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成[17]。研究顯示，腰椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝的重要因子之一BMP-2，可以促進(jìn)體外培養(yǎng)腰椎間盤細(xì)胞的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成以及表達(dá)[18,19]。同時(shí)，BMP-2在腰椎間盤退變中有一定的調(diào)節(jié)作用，參與腰椎間盤退變整個過程的調(diào)節(jié)[20]。

本文研究結(jié)果顯示，在兩組研究對象中，退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達(dá)量明顯升高，BMP-2表達(dá)明顯下降；腰椎間盤突出患者Ⅱ級退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達(dá)量低于Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者，BMP-2表達(dá)量高于Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級患者；腰椎間盤突出患者腰部負(fù)荷重程度退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體表達(dá)量高于很輕、中程度患者，BMP-2表達(dá)量低于很輕、中程度患者。說明腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中NALP3炎性體、BMP-2存在重要的參與作用。

綜上所述，NALP3炎性體在腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中高表達(dá)，BMP-2在腰椎間盤突出患者退變腰椎間盤髓核組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與患者退變腰椎間盤髓核組織中退變等級、腰部負(fù)荷程度相關(guān)，NALP3炎性體、BMP-2在退變腰椎間盤髓核組織中起到重要的參與作用。