豬丹毒絲菌spaA 基因的敲除及其致病作用的初步研究

陳富海，林曉君，凃彥芳，劉博婷，余 璐，蔡鞏林，林錦銓，彭 凌

（韶關學院 英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）可使豬患一種急性、熱性、敗血性傳染病，即豬丹毒.臨診癥狀急性型表現為敗血癥，亞急性表現為皮膚上出現疹塊.慢性病豬表現為心內膜炎和關節炎.各國研究人員對丹毒絲菌的研究已有一百多年，然而對其致病機制及毒力因子目前還未研究清楚［1］.從眾多研究可知丹毒絲菌屬各種菌株的毒力差別很大，有66%的紅斑丹毒絲菌會使動物致病，也有將近96%的扁桃體丹毒絲菌對動物無害.1882 年，Pasteur 首次從豬體內分離到此菌，對引起豬丹毒的病原進行精確描述是由Loffler 完成的，同時他還描述了豬感染該菌后出現的臨床癥狀，這是第一個描述這種有機體作為傳染性病原體引起豬的疾病.1883 年，Pasteur 和Thuillier 首次使用豬丹毒疫苗，此后，這種弱毒活疫苗和菌苗被長期用于控制豬和火雞的丹毒病癥［2］.豬丹毒絲菌在養殖業、食品衛生安全以及人體健康等方面帶來了極大的威脅［3-4］.豬丹毒絲菌感染會引起熱性或急性人畜共患的傳染病，主要的傳染源是病豬以及各種帶菌動物（最主要是帶菌豬）［5］.滅活疫苗、弱毒疫苗是現有的預防手段，但仍存在缺點，如保護周期短、保護率低等［6］，而新一代的亞單位疫苗也存在免疫譜窄的弱點.現發現反向疫苗可以用細菌的毒力因子作研究的重要線索，同時探索毒力因子的種類并研究其功能，還將在研制安全高效的疫苗方面提供重要的理論基礎.因此對丹毒絲菌毒力因子的研究為了解各毒力因子相互關聯及其致病機制提供證據，并為有效減少豬丹毒對養殖業所造成的經濟損失做出貢獻.

筆者以臨床分離的豬丹毒絲菌野生強毒株為材料，采用DNA 重組技術構建spaA 基因敲除載體，并利用該敲除載體結合同源重組技術敲除強毒株上的spaA 基因.然后比較強毒株和敲除株小鼠毒力的差異來揭示SpaA 在致病中的初步作用，并為進一步揭示SpaA 在致病中的作用機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

豬丹毒絲菌野生株SG7、大腸桿菌DH5α（由本實驗室保存）.

1.1.2 實驗試劑

氨芐青霉素、瓊脂糖、HindⅢ酶 、Pst Ⅰ酶、XbaⅠ酶、SmaⅠ酶、T4 DNA 連接酶、2×Pfu PCR Mix、SanPrep 柱式質粒小量抽提試劑盒、質粒載體pUC18、SanPrep DNA 抽提取試劑盒、SanPrep 柱式PCR 產物純化試劑盒等均購買于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.1.3 儀器

2720Thermal Cycler（美國Applied biosystem 公司）、JS-680 凝膠成像分析系統（上海培清科技有限公司）、HZQ-F 恒溫振蕩培養箱、3K18 高速冷凍離心機（美國Sigma）、Ultrospec2000 紫外/可見分光光度計（美國Amersham Pharmacia Biotech）、DYY-6B 型穩壓溫流電泳儀（北京市六一儀器廠）.

1.1.4 培養基

TSB 培養基：酵母粉0.5%，牛肉粉2.5%，胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.2%，Tween 80 0.05%；LB 培養基： 胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%.

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據spaA 基因序列的上下游序列、Amp 抗性基因序列和載體pUC18 的多克隆位點，采用Primer Premier 5.0 軟件設計引物Up-s/Up-As、DOWN-s/DOWN-As 和Amp-s/Amp-As，分別根據spaA 基因設計和spaA 基因上下游區域設計內引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/OUT-2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.引物信息見表1（斜體加粗部分為酶切位點）.

表1 引物序列和位置

1.2.2 目的片段的制備

以豬丹毒絲菌基因組DNA 作為模板，用表1 的引物分別擴增上游片段L、下游片段R 和Amp 抗性基因A. PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收后分別用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Xba Ⅰ+Sma Ⅰ、Pst Ⅰ+Xba Ⅰ.雙酶切反應體系：目的片段或質粒載體（1～3μg），10×Tango Buffer（10μL），酶（2.5μL），用ddH2O 補足至總體積100μL. 37 ℃溫育3 h，65 ℃熱水浴15 min 使酶滅活，并回收酶切產物.

1.2.3 L、R 和A 片段的克隆

質粒載體經Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后與經同樣酶切處理的上游片段L 連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB 培養基，37℃培養過夜，挑取單菌落進行擴培，經質粒提取、雙酶切和測序鑒定篩選出陽性克隆子pUC18-L.pUC18-L 經Pst Ⅰ和Xba Ⅰ酶切后與經同樣酶切處理的Amp 抗性基因A 段相連，經轉化、篩選和鑒定后獲得正確重組質粒pUC18-LA.pUC18-LA 經過Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切后與同樣酶切處理的下游片段R 相連，經轉化、篩選和鑒定最終獲得敲除載體pUC18-LAR.

1.2.4 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

用SanPrep 柱 式 質 粒 小 量 抽 提 試 劑 盒 提 取 質 粒，用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ、Hind Ⅲ+Xba Ⅰ、HindⅢ+SmaⅠ進行交叉雙酶切鑒定.雙酶切體系：DNA（8.5μL），兩種酶（各0.5μL），10×Tango Buffer（1μL），37 ℃酶切1h.酶切產物經65 ℃熱水浴15 min 使酶失活.經酶切鑒定正確的陽性克隆子，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序.

1.2.5 豬丹毒絲菌感受態制備

挑選豬丹毒絲菌單菌落接種于TSB 液體培養基（10 mL）中30℃培養16 h，取菌液（0.1 mL）轉接于TSB 液體培養基（10 mL），37 ℃培養至對數期（OD600=0.4），菌液經30 min 冰浴后，分裝于預冷的離心管中，4 ℃離心（6 000 g/min）15 min 后，去上清，用預冷超純水重懸菌體沉淀，4 ℃離心（8 000 r/min）15min，重復兩次后，用500μL 14%預冷甘油溶液重懸細菌.

1.2.6 基因敲除菌的構建

將鑒定正確的敲除載體pUC18-LAR（10 μL）與豬丹毒絲菌感受態（100 μL）置于冰上輕柔的混勻10 min.混合物在1.25 kv、600 Ω、25 μF 的電轉參數下進行電轉化.電轉化后，用37 ℃預溫的TSB 培養基（950 μL，含馬血清5%）懸浮細菌，37 ℃振蕩培養3 h，離心（4 000 r/min）5 min 后涂布于TSB 瓊脂培養基（含5 μg/mL 氨芐青霉素）.

1.2.7 基因敲除株的鑒定

為檢測spaA 基因片段是否被抗性基因替換而缺失，挑取氨芐青霉素平板上的單菌落為模板，用表1的內引物IN-1/IN-2 和外引物OUT-1/ OUT-2 分別進行PCR 鑒定.反應體系：2×PCR Mix（5μL），引物（各0.5μL），豬丹毒絲菌野生株SG7 基因組DNA 或疑似菌DNA（1μL），ddH2O（8μL）.反應條件：94 ℃預變性 5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸4 min，30 個循環后終延伸72 ℃ 10 min.將引物OUT-1/OUT-2 PCR 擴增產物進行測序鑒定，獲得的基因敲除株暫命名為SG7ΔspaA.

1.2.8 小鼠毒力試驗

根據預試驗結果，將55 只BALB/c 小鼠隨機分成2 個大組，野生株SG7大組分5 個小組，敲除株SG7ΔspaA分為6 小組，每小組5 只.將兩種菌株培養后，采用10 倍梯度進行稀釋后攻毒，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 梯度濃度菌液，對照鼠注射0.5 mL TSB液體培養基.對小鼠進行連續觀察并記錄小鼠發病及死亡情況，用Reed-Muench 法計算2 個菌株對小鼠的半數致死量.

2 結果分析

2.1 目的片段的擴增

目的片段的PCR 擴增結果見圖1，結果顯示上游片段L 長度大小為（1 107 bp），下游片段R 片段長度大小為（924 bp），Amp 抗性基因A 長度大小為（861 bp），與設計的片段大小一致.

圖1 目的片段的PCR擴增

圖2 重組載體pUC18-LAR 酶切鑒定電泳圖

2.2 敲除載體pUC18-LAR 的鑒定

pUC18-LAR 的酶切鑒定見圖2，結果顯示pUC18-L 用Hind Ⅲ+Pst Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp 和1 107 bp 兩 個 片 段，pUC18-LA 用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ雙 酶 切 后 獲 得2 686 bp 和1 968 bp 兩 個 片 段，pUC18-LAR 用Hind Ⅲ+Sma Ⅰ雙酶切后獲得2 686 bp、2 892 bp 兩個片段表明L、A、R 片段連接正確，測序結果表明3 個片段連接順序正確，無發生突變.

2.3 突變菌株的鑒定

基因敲除載體pUC18-LAR 電轉豬丹毒絲菌感受態細胞后，平板上長出若干單菌落，采用內引物IN-1/IN-2 進行菌落PCR 鑒定，結果見圖3，野生株能擴增出符合預期大小（1 402 bp）的條帶，有3 個菌落沒有擴增出條帶，可能為疑似敲除株，以這3 個疑似菌為模板用引物外引物OUT-1/OUT-2 鑒定，結果見圖4，以pUC18-LAR 作為陽性對照，結果顯示，只有一個疑似菌株擴增出與陽性對照一致大小的片段（2 365 bp），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果說明此菌敲除成功.

圖3 內引物IN-1/IN-2 菌落PCR 鑒定結果

圖4 引物OUT-1/OUT-2 菌落PCR 鑒定結果

2.4 小鼠毒力試驗結果

野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對小鼠LD50（半數致死量）的測定統計數據見表2 和表3.根據Reed-Muench 法計算2 個菌株的半數致死量，野生株SG7 和敲除株SG7ΔspaA.對小鼠LD50 的分別為7.3×103CFU/mL 和7.45×105CFU/mL，與野生株相比敲除株SG7ΔspaA. 對小鼠的毒力降低102 倍.

表2 野生株SG7 株對小鼠LD50 的測定

表3 敲除株SG7ΔspaA 對小鼠LD50 的測定

3 討論

豬丹毒為散發性或地方流動性傳染病，有時也出現爆發性流行，各種年齡和品種的豬均易感，給全球各地的養殖業帶來影響.有研究通過對比不同年代菌株的基因發現spaA 基因為保守基因，同源性近100%［12-13］.SpaA 是豬丹毒絲菌的主要免疫保護性抗原，幾乎存在于所有毒力較強的菌株中，主要的保護功能核心區段為氨基端，且是由抗體介導的免疫保護［14-17］.SpaA 本實驗構建了spaA 基因敲除載體，與spaA 基因上下游序列有部分同源序列，通過同源重組使得spaA 基因被敲除.電穿孔轉化具有轉化率高，幾乎所有的細菌都有一套與之匹配的電穿孔操作條件的優點，故本實驗利用該方法將豬丹毒絲菌spaA 基因敲除載體pUC18-LAR 導入野生株SG7 獲得基因敲除株SG7ΔspaA.敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對小鼠的毒力降低了102 倍，與豬丹毒絲菌的致病性有關.為其致病機制和相關的疫苗研發奠定了一定的基礎.

4 結論

測序結果表明豬丹毒絲菌敲除株SG7ΔspaA 構建成功.通過小鼠毒力實驗證明，敲除株SG7ΔspaA 相較于野生株對小鼠的毒力降低了102 倍，證實SpaA 確實與豬丹毒絲菌的致病性有關，為后繼的相關實驗提供一定的參考.