結直腸癌組織中APC、β-catenin和COX-2的表達及臨床意義

顧冬梅，覃玲艷，干文娟，虞 杰，尤志群，郭凌川，王修珍

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前結直腸癌占全球癌癥發病率的第4位，病死率的第2位[2]。相關研究[3]表明結直腸癌發生與Wnt信號通路的異常調節有關。結腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)是Wnt信號通路的成員之一，其突變與結直腸癌的發生密切相關[4]。β-catenin即β-連接蛋白，是Wnt信號通路的關鍵分子，其在結直腸癌的發病機制中起重要作用。COX-2是一種可誘導的前列腺素合成酶(prostaglandin G/H synthase, PTGS)，是Wnt信號通路的下游靶基因[5]。本實驗應用組織芯片聯合全自動免疫組化EnVision兩步法檢測Wnt信號通路成員APC、β-catenin和COX-2在結直腸癌組織和癌旁正常結直腸組織中的表達，分析三者表達與結直腸癌臨床病理特征的關系，探討其在結直腸癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集蘇州大學附屬第一醫院2011年1月～2015年12月存檔的112例結直腸癌手術切除標本，其中結腸癌59例，直腸癌53例；男性59例，女性53例；患者年齡31～91歲，平均61.86歲；腫瘤直徑≤5 cm者81例，>5 cm者31例；依據WHO(2010)消化系統腫瘤分類標準[6]對各病例進行分類：高分化2例，中分化97例，低分化13例；有淋巴結轉移66例，無淋巴結轉移46例，伴遠處臟器轉移10例；未侵及漿膜層36例、侵及漿膜層76例；Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期68例。患者術前均未進行放、化療等治療。另選取對應的距離癌組織2 cm的癌旁正常結直腸組織作為對照。所有組織均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水浸蠟，石蠟包埋。

1.2 方法選取所需病例組織蠟塊，制作組織芯片陣列(圖1)，3 μm厚連續切片，采用免疫組化EnVision兩步法染色。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，用PBS替代一抗做陰性對照。兔抗人APC多克隆抗體，兔抗人COX-2單克隆抗體，均購自北京中杉金橋公司；鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自上海基因公司；免疫組化EnVision試劑盒及其他試劑均購自美國羅氏公司。

AB

圖1結直腸癌組織(A)和正常結直腸組織(B)的組織芯片蠟塊

1.3 判讀標準APC和COX-2陽性定位于細胞質或細胞膜，呈棕黃色顆粒狀。按陽性細胞百分比評分：≤4%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。按細胞染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為()，5分以上為()，其中≥3分為陽性[7]。β-catenin陽性呈棕黃色細小顆粒狀，以細胞膜染色陽性且陽性細胞數≥70%為正常表達，細胞質和(或)細胞核染色陽性且細胞數≥10%為異位表達。出現細胞膜表達減弱或缺失以及異位表達均視為異常表達[8]。

1.4 統計學分析應用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。表達的差異性采用χ2檢驗、校正χ2檢驗；相關性采用Spearman秩相關檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和正常結直腸組織中APC、β-catenin和COX-2的表達APC在結直腸癌組織和癌旁正常結直腸組織中的陽性率分別為40.2%(45/112)、93.8%(105/112)(圖2)。β-catenin在正常結直腸組織中的表達主要定位于細胞膜，在結直腸癌組織中的表達主要定位于細胞質和(或)細胞核。β-catenin在結直腸癌組織和癌旁正常結直腸組織中的陽性率分別為72.3%(81/112)、10.7%(12/112)(圖3、4)；COX-2在結直腸癌組織和癌旁正常結直腸組織中的陽性率分別76.8%(86/112)、11.6%(13/112)(圖5)，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

②③④⑤

圖2APC在正常結直腸組織中呈細胞質陽性，EnVision兩步法

圖3β-catenin在結直腸癌組織中的異位表達，呈細胞質陽性，EnVision兩步法圖4β-catenin在結直腸癌組織中的異位表達，呈細胞核陽性，EnVision兩步法圖5COX-2在結直腸癌組織中呈細胞質和細胞膜陽性，EnVision兩步法

2.2 結直腸癌中APC、β-catenin和COX-2表達與臨床病理特征的關系APC蛋白表達與腫瘤分化程度相關(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小、位置、腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期均無關(P>0.05，表2)。β-catenin和COX-2蛋白表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期相關(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、位置均無關(P>0.05，表2)。

2.3 結直腸癌組織中APC、β-catenin和COX-2表達的相關性在結直腸癌組織中，APC表達與β-catenin的異常表達、COX-2的表達呈負相關(rs=-0.551，P<0.01；rs=-0.542，P<0.01)；β-catenin的異常表達與COX-2的表達呈正相關(rs=0.558，P<0.01，表3)。

3 討論

結直腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率逐年呈遞增趨勢，預計2030年全球發展中國家結直腸癌的發病率高達60%[9]。腫瘤的發生、發展是受多因素影響的復雜過程，Wnt信號通路上一些關鍵因子的調控與結直腸癌的發生密切相關。

APC是一種親水性胞質蛋白，定位于結直腸黏膜上皮細胞的基膜。臨床研究發現，約70%的結直腸癌存在APC基因缺失或突變[10]。正常的APC蛋白與Axin和β-catenin相結合，并通過GSK-3β促進β-catenin磷酸化[11]，激活Wnt信號通路，促進細胞大量增殖、分化，誘發癌變。本組實驗中APC在結直腸癌組織中的陽性率為40.2%(45/112)低于正常結直腸組織(93.8%，105/112)，且APC蛋白在結直腸癌高+中分化組中的表達顯著高于低分化組(P<0.05)，這與Nelson等[12]對APC蛋白功能的研究結果一致，提示APC蛋白失表達在結直腸癌的發生、發展中起重要作用。

β-catenin蛋白主要定位于細胞膜。在細胞癌變過程中，游離的β-catenin積聚于細胞質，并隨濃度上升進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，促進下游靶基因的激活與異常轉錄[13]。在本組癌旁正常結直腸組織中，β-catenin主要表達于細胞膜，在結直腸癌中，β-catenin主要異常表達于細胞質和(或)細胞核。β-catenin在結直腸癌組織中的異常表達率為72.3%(81/112)，遠高于正常結直腸組織。提示β-catenin在腫瘤細胞中有按胞膜→胞質→胞核方向流動的趨勢，這與Peker等[14]的研究結果相符。本組實驗結果顯示，在結直腸癌組織中，β-catenin的表達與腫瘤分化程度呈負相關，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期呈正相關(P<0.05)，提示β-catenin的異常表達對結直腸癌的分化、侵襲及轉移有重要影響。

表1 結直腸癌組織和癌旁正常結直腸組織中APC、β-catenin和COX-2的表達

表2 結直腸癌中APC、β-catenin和COX-2的表達與臨床病理特征的關系

表3 結直腸癌組織中APC、β-catenin和COX-2表達的相關性

COX-2即誘導型環氧化酶，在機體受各種炎癥介質、激素及促瘤因素等的刺激作用下高表達[15]，是Wnt通路的靶基因。本組實驗結果顯示，COX-2在結直腸癌組織中高表達(76.8%，86/112)與Mahmoud等[16]的研究結果一致。相關研究表明，COX-2過表達可抑制E-cadherin的功能，使腫瘤細胞黏附性降低，促使腫瘤局部浸潤和遠處轉移。本組實驗結果顯示，在結直腸癌組織中，COX-2表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)。提示COX-2有可能成為判斷結直腸癌生物學行為及評估預后的重要標志物。

在Wnt信號通路中，APC的突變或缺失可導致β-catenin大量聚集進入細胞核內與TCF/LEF1轉錄因子結合，激活下游靶基因。COX-2含有TCF結合位點，是β-catenin通路的下游靶基因，β-catenin的異常表達可上調COX-2的表達[5]。本組實驗結果表明，在結直腸癌組織中APC的表達與β-catenin的異常表達呈負相關(rs=-0.551)，β-catenin的異常表達與COX-2的表達呈正相關(rs=0.558)，提示APC蛋白失活是β-catenin異常表達的誘因，β-catenin異常聚集可通過增加COX-2的過表達促進腫瘤的演變。由此認為APC突變→引起β-catenin積聚→β-catenin與轉錄因子TCF/LEF1結合→激活COX-2→致癌，因此APC功能缺失導致COX-2轉錄作用失控，從而誘發癌變。

綜上所述，本實驗應用組織芯片聯合全自動免疫組化EnVision兩步法檢測APC、β-catenin和COX-2在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系，表明三者通過Wnt信號通路共同參與結直腸癌的發生、發展過程，促進腫瘤的演變。因此單獨或聯合檢測APC、β-catenin和COX-2的表達，有助于提高結直腸癌的臨床診斷、評估預后和研發抗腫瘤藥物的新靶點。