冷凍切片后甲醛固定石蠟包埋組織DNA質(zhì)量分析

鄭 晶，蒙秋萍，翁 陽(yáng)

在病理科日常工作中，為協(xié)助外科醫(yī)師及時(shí)確定手術(shù)范圍并做出相應(yīng)的處理，病理醫(yī)師有時(shí)需要在手術(shù)過(guò)程中做出快速診斷，尤其是腫瘤的良、惡性診斷，快速冷凍切片是應(yīng)用最廣泛的方法。該方法通常是在手術(shù)過(guò)程中切取部分病變組織，用冷凍切片技術(shù)制片后用以病理診斷。冷凍切片后組織經(jīng)甲醛固定制成蠟塊，并切片及HE染色，以便與術(shù)中冷凍切片比較，來(lái)驗(yàn)證冷凍切片結(jié)果的準(zhǔn)確性；若送檢標(biāo)本較多，未經(jīng)冷凍切片的送檢組織也需固定后制成蠟塊，并進(jìn)行切片及HE染色，以便進(jìn)一步明確診斷，必要時(shí)進(jìn)行用于指導(dǎo)用藥及預(yù)后判斷的分子病理學(xué)檢測(cè)。但有時(shí)病變組織少或送檢組織有限，為確保術(shù)中快速冷凍病理診斷的準(zhǔn)確性，需將全部組織進(jìn)行冷凍切片。這樣就只剩下冷凍切片后凍融組織而缺乏常規(guī)石蠟包埋組織來(lái)進(jìn)行分子病理學(xué)診斷。冷凍切片后凍融組織再行固定及包埋對(duì)形態(tài)及蛋白水平檢測(cè)的負(fù)面影響已被廣泛認(rèn)同[1-3]。但凍融后再行固定及包埋對(duì)組織DNA水平的影響卻鮮有報(bào)道。因此，本文以肺腺癌組織為代表，分析冷凍切片后甲醛固定石蠟包埋組織DNA質(zhì)量，以探討其在分子病理檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2017年12月～2018年5月確診為“肺腺癌”且經(jīng)術(shù)中快速冷凍病理診斷14例組織標(biāo)本，同一病例包含2個(gè)組織蠟塊：一個(gè)為冷凍切片后凍融組織再行固定及包埋蠟塊，另一個(gè)為送檢剩余病變組織(未經(jīng)冷凍切片)常規(guī)固定及包埋蠟塊。

1.2 試劑QIAamp DNAFFPE Tissue Kit DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)及Amoy Dx人類EGFR基因21種突變檢測(cè)試劑盒(廈門艾德公司)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 依據(jù)HE切片上腫瘤細(xì)胞的分布，在蠟塊表面勾勒出腫瘤細(xì)胞集中區(qū)域，并用刀片在該區(qū)域內(nèi)將組織塊修成大小1.0 cm×1.0 cm，每個(gè)蠟塊切4片，每片厚度為5 μm，以保證用于提取DNA的組織大小基本一致。DNA提取操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2DNA濃度和純度檢測(cè) NanoDrop 2000型全波長(zhǎng)超微量分光光度計(jì)測(cè)量提取DNA濃度及OD260/OD280比值。

1.3.3DNA完整性檢測(cè) 以提取DNA為模版，行多重PCR反應(yīng)。參照Biomed-2系統(tǒng)，設(shè)置4個(gè)內(nèi)參目的基因，分別為TBXAS1(外顯子9；GenBank登錄號(hào)D34621)、RAG1(外顯子2；GenBank登錄號(hào)M29474)、PLZF(外顯子1；GenBank登錄號(hào)AF060568)和AF4基因(外顯子3，GenBank登錄號(hào)Z83679)，大小分別為100、200、300及400 bp。引物序列分別為：TBXAS1：上游5′-GCCCGACATTCTGCAAGTCC-3′,下游5′-GGTGTTGCCGGGAAGGGTT-3′；RAG1：上游5′-TGTTGAC GCTATCCACCCCA-3′，下游5′-TGAGCTGCAAGTTTGGCTGA A-3′；PLZF：上游5′-TGCGATGTGGTCATCATGGTG-3′，下游5′-CGTGTCATTGTCGTCTGAGGC-3′；AF4：上游5′-CCGCAG CAAGCAACGAACC-3′，下游5′-GCTTTCCTCTGGCGGCTCC-3′。將引物混合，行多重PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃預(yù)變性7 min，95 ℃變性45 s，退火60 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 90 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行聚丙烯酰胺垂直電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。

1.3.4ARMS法 采用ARMS法對(duì)EGFR基因突變進(jìn)行檢測(cè)。提取DNA產(chǎn)物為模板，DNA稀釋濃度為1.2～1.5 ng/μL；EGFR基因突變21位點(diǎn)，包括18、19、20及21外顯子，位點(diǎn)包含除了含有13種Ex19DeL以及Ex21-L858R、Ex20-T790M、Ex20-ins、3種Ex18-G719X(G719A、G719S、G719C)、Ex20-S768I及Ex21-L861Q，21種突變。突變探針由FAM信號(hào)指示，內(nèi)控由VIC信號(hào)指示，外控管由FAM信號(hào)指示。內(nèi)控和外控選擇的檢測(cè)區(qū)域是人類EGFR基因相對(duì)保守區(qū)段，約100 bp，用于監(jiān)控檢測(cè)樣本DNA質(zhì)量和PCR反應(yīng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。EGFR的PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 25 s，64 ℃ 35 s(采集熒光)，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)。基因突變結(jié)果判定：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書提供檢驗(yàn)結(jié)果解釋進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度及OD260/OD280比值冷凍切片后固定包埋組織和常規(guī)包埋組織兩組DNA濃度均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.76，P<0.001)，前者DNA濃度低于后者，均數(shù)分別為157.33 ng/μL和349.97 ng/μL。兩組DNA提取物OD260/OD280比值均數(shù)的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.69，P=0.001)，常規(guī)包埋組織DNA提取物OD260/OD280比值高于凍融后包埋組織，均數(shù)分別為2.02和1.96(表1)。

表1 冷凍切片后固定包埋組織和常規(guī)固定包埋組織DNA濃度及OD260/OD280比值

2.2 DNA完整性結(jié)果14例常規(guī)固定包埋組織提取的DNA均具有>300 bp的PCR產(chǎn)物，并且其中有10例具有>400 bp的PCR產(chǎn)物，且目標(biāo)條帶均較清晰。14例冷凍切片后固定包埋組織提取的DNA(圖1)具有>300 bp PCR產(chǎn)物者有11例，僅有5例獲得>400 bp的PCR產(chǎn)物(第4、6、13、14、15泳道，部分目的條帶較弱)，所有冷凍切片后包埋組織DNA均具有>200 bp的PCR產(chǎn)物。

圖1 冷凍切片后冰對(duì)組織DNA內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(7、12為50 bp Marker)

2.3 EGFR突變檢測(cè)結(jié)果14例肺腺癌組織中有7例檢測(cè)出EGFR突變，其中21號(hào)外顯子的L858R突變4例，21號(hào)外顯子的L861Q突變1例，19號(hào)外顯子的缺失突變2例。冷凍切片后包埋組織與常規(guī)包埋組織EGFR突變檢測(cè)結(jié)果完全相同，且兩組內(nèi)控、外控信號(hào)均正常。

3 討論

石蠟包埋組織作為一種最為方便且保存最為長(zhǎng)久的臨床檢測(cè)標(biāo)本，是分子病理研究的主要信息來(lái)源。在病理科日常工作中，術(shù)中快速冷凍病理診斷是不可或缺的一部分。有時(shí)術(shù)中冷凍送檢病變組織少或有限，為確保冷凍診斷的準(zhǔn)確性，需將全部送檢病變組織進(jìn)行冷凍切片。這樣就只剩下冷凍切片凍融后組織而缺乏常規(guī)石蠟包埋組織來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的病理學(xué)診斷及分子病理學(xué)檢測(cè)。高質(zhì)量的DNA是分子病理診斷順利開展的基礎(chǔ)。DNA的質(zhì)量評(píng)價(jià)一般從三個(gè)方面進(jìn)行，包括DNA濃度、純度以及DNA的完整性[4-5]。研究表明，新鮮冷凍組織DNA質(zhì)量在以上三個(gè)方面均優(yōu)于甲醛固定石蠟包埋組織[6]。那么冷凍切片后再行固定、包埋組織中提取的DNA質(zhì)量如何，其濃度、純度以及DNA的完整性與常規(guī)固定包埋組織的DNA相比，是否存在差異，能否用來(lái)進(jìn)行分子病理學(xué)檢測(cè)呢？

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與常規(guī)固定包埋組織相比，冷凍切片后再行固定及包埋冰對(duì)組織中提取的DNA濃度明顯下降，DNA完整性亦不及常規(guī)固定包埋組織，DNA片段化更為嚴(yán)重。由于冰對(duì)組織前期處理中有迅速冷凍及較快凍融的過(guò)程，后續(xù)處理過(guò)程與冰剩組織無(wú)異。因此筆者推測(cè)冷凍處理會(huì)對(duì)組織DNA質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響。有研究表明，冷凍處理會(huì)對(duì)細(xì)胞以及細(xì)胞核酸成分產(chǎn)生損傷。損傷機(jī)制包括：(1)冷凍過(guò)程可導(dǎo)致產(chǎn)生的高濃度活性氧成分(reactive oxidative species, ROS)增加，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成細(xì)胞DNA完整性破壞[7-8]；(2)在快速冷凍降溫過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)部的水分來(lái)不及外滲，就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)冰晶，甚至核內(nèi)冰晶。冰晶與細(xì)胞膜、細(xì)胞器及細(xì)胞內(nèi)各種成分的破壞有著很大的關(guān)系，且冰晶相對(duì)于脫水，其對(duì)細(xì)胞的損傷是致命的。核內(nèi)冰晶的形成亦會(huì)對(duì)核酸結(jié)構(gòu)造成破壞[9]；(3)冷凍后凍融過(guò)程中，溫度劇烈變化可引起細(xì)胞化學(xué)結(jié)構(gòu)不同程度的改變，能量代謝紊亂，DNA鏈的完整性遭到破壞等[10]；這些研究結(jié)果也一定程度上證實(shí)了筆者的推測(cè)，冷凍及凍融處理的確會(huì)對(duì)組織DNA造成一定程度的損傷。并且筆者認(rèn)為，凍融過(guò)程使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會(huì)產(chǎn)生更多游離的蛋白與核酸，在福爾馬林固定過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生更多的蛋白核酸交聯(lián)，使得DNA的片段化更為嚴(yán)重。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中亦發(fā)現(xiàn)，冷凍切片后包埋組織DNA提取物OD260/OD280比值低于常規(guī)包埋組織。目前常用的核算提取方法均會(huì)使產(chǎn)物中夾雜一些其它的分子，如蛋白、小分子化合物等，這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)后續(xù)的檢測(cè)產(chǎn)生影響。檢測(cè)核酸純度最常用的方法是利用分光光度計(jì)測(cè)定紫外吸光度。DNA的紫外吸收峰值在260 nm處，而蛋白質(zhì)為280 nm。因此蛋白質(zhì)含量高可導(dǎo)致OD260/OD280比值降低。本實(shí)驗(yàn)中冷凍切片后組織DNA提取物OD260/OD280比值低于常規(guī)包埋組織，分析原因：凍融過(guò)程使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會(huì)產(chǎn)生更多游離的蛋白質(zhì)與核酸，在福爾馬林固定過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生更多的蛋白核酸交聯(lián)，繼而會(huì)降低蛋白酶的消化效率。因此凍融后固定組織核酸提取物中蛋白質(zhì)污染比常規(guī)固定組織更為嚴(yán)重。

凍融后再行固定包埋冰對(duì)組織中提取的DNA能否用于分子病理學(xué)檢測(cè)呢？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然冷凍切片后固定包埋組織DNA的濃度及DNA完整性均稍劣于常規(guī)固定包埋組織的DNA。但DNA的濃度平均值為157.33 ng/μL，仍然屬于較高濃度的DNA水平；OD260/OD280比值均值為1.96，同樣為純度較好的DNA樣本；不同的檢測(cè)方法或檢測(cè)試劑盒對(duì)被檢查樣本的DNA濃度要求不盡相同。常見的ARMS法對(duì)樣本DNA的起始濃度范圍1～3 ng/μL，熒光PCR法的范圍20～30 ng/μL，Sanger測(cè)序的范圍約60 ng/μL，高通量測(cè)序中Ion Torrent檢測(cè)平臺(tái)的范圍2～5 ng/μL，ILLumia檢測(cè)平臺(tái)的范圍10～60 ng/μL[5]。因此，從DNA濃度分析，冷凍切片后再行固定包埋冰對(duì)組織中提取的DNA適用于目前常用的分子病理檢測(cè)平臺(tái)。完整性方面，所有標(biāo)本均能獲得200 bp的PCR產(chǎn)物，且大部分標(biāo)本能獲得300 bp的PCR產(chǎn)物，甚至部分獲得400 bp的PCR產(chǎn)物。因此凍融后組織DNA片段亦能滿足ARMS法及大多數(shù)測(cè)序檢測(cè)平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)中ARMS法檢測(cè)冷凍切片后包埋組織與常規(guī)包埋組織EGFR突變檢測(cè)結(jié)果完全相同，且內(nèi)控、外控均正常。在實(shí)際應(yīng)用中亦證實(shí)凍融后固定包埋組織的DNA，可以滿足常規(guī)分子病理檢測(cè)要求。