超聲快速石蠟與常規石蠟在胃腸道間質瘤Sanger測序中結果的對比分析

張 茜，楊月紅，章宏峰

隨著病理技術的發展，各種利用超聲震動、恒溫水浴和專用試劑對病理組織完成固定、脫水、透明全過程于一體的病理組織處理儀得到廣泛應用，是目前國內病理科常用的快速制片方法之一[1]。因其方法簡便快捷、省時省力，很多病理科會用超聲快速石蠟方法對胃腸鏡活檢組織進行制片，據文獻報道，在某些活檢組織中，超聲快速石蠟制片可以獲得跟常規制片一致的HE染色的形態學結果[2]。在后續沒有手術大標本的情況下，還需要用活檢組織對胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumour, GIST)的患者進行Sanger測序檢測C-Kit和PDGFRA基因突變的情況。本文主要探討經超聲快速脫水處理的組織在GIST Sanger測序中對C-Kit和PDGFRA基因突變檢測結果的影響，以及與常規脫水組織在GIST Sanger測序中的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測結果的對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料收集武漢市中心醫院病理科2018年3～9月的胃腸道手術標本，每例標本常規取材時另在腫塊相鄰部位上取大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的組織2塊分別進行超聲快速脫水和常規脫水，制成蠟塊后備用。待常規病理及免疫組化檢測診斷后選取GIST 18例，其中男性8例，女性10例，患者年齡45～83歲，中位年齡66歲。儀器設備為HT-3型快速組織處理系統(山東駿騰醫療科技公司)和全自動密閉式組織脫水機(Leica ASP300S)，GIST C-it和PDGFRA基因突變檢測試劑盒購自上海源奇生物公司。

1.2 方法

1.2.1組織處理 將所取每例組織大小0.3 cm×0.3 cm×0.2 cm的2塊組織中的一塊立即放入快速組織處理儀中進行超聲快速石蠟制片，超聲快速石蠟制片方法如下：將組織放入第一缸的快速處理液中處理10 min；再將組織浸入第二缸的快速處理液中處理10 min；用濾紙吸取組織表面殘留的處理液，放入預先融化的石蠟中10 min，等到組織完全下沉不再有氣泡為止。取出組織迅速置于石蠟包埋機中進行石蠟包埋。另一塊行常規石蠟處理。待常規病理及免疫組化檢測確診為GIST后，將兩種方法制得的蠟塊同時進行C-Kit和PDGFRA基因檢測。

1.2.2核酸提取 取已制備好的同一患者的常規石蠟組織和超聲快速石蠟組織蠟塊，每塊切片10張，厚度為3 μm，制成組織切片，取連續切片的第一張和最后一張切片做常規HE染色，評估腫瘤細胞的含量和比例。根據評估的結果刮取腫瘤組織細胞到1.5 mL的EP管中，加入二甲苯1 mL脫蠟，離心去上清后加入無水乙醇，再離心去上清后將組織放置在通風處烘干。在EP管中加入180 μL的ATL消化液和20 μL的蛋白酶K，于56 ℃的水浴鍋中消化3 h，90 ℃水浴鍋中孵育1 h，樣本室溫冷卻后，加入200 μL的DNA結合液和200 μL的無水乙醇，振蕩混勻離心后過吸附柱，經2輪洗滌后，加入ATE緩沖液回收富集DNA。

1.2.3核酸定量 用Nanodrop 2000分光光度計對提取的DNA進行測量，確定核酸的濃度和純度。

1.2.4PCR擴增 根據上海源奇生物公司的腫瘤相關基因突變檢測試劑盒說明書的要求配置PCR MIX混合體系，加22 μL的需要擴增的外顯子反應液和3 μL的DNA，總反應體系為25 μL。擴增條件為：42 ℃預處理5 min，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，擴增40個循環后，72 ℃延伸10 min。

1.2.5酶消化 取5 μL的PCR擴增產物，加2 μL的SAP MIX酶進行酶消化，消化程序設置為37 ℃孵育1 h，85 ℃處理15 min。

1.2.6測序PCR擴增 根據試劑盒說明書配置測序PCR反應體系，取3 μL的酶消化產物，加入2 μL的測序引物和1 μL的Bigdye液，總反應體系為6 μL。擴增條件為：96 ℃預變性1 min，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸5 min，擴增30個循環，產物放置在4 ℃冰箱內保存。

1.2.7測序PCR產物純化 每個0.2 mL的EP管中加入3 μL的0.125 mol/L的EDTA，再加入30 μL的無水乙醇，震蕩3次后室溫放置15 min；12 000 r/min離心30 min，棄去上清液；加入70 μL預冷的70%乙醇，冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入70 μL 預冷的70%乙醇，冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清；將離心管放置在通風處，使乙醇徹底揮發；加入10 μL的Hi-Di Formamide變性劑，迅速置于95 ℃的水浴鍋中孵育5 min，取出置于冰上。

1.2.8上機測序 純化后的產物即可在ABI 3500Dx基因分析儀上測序并分析。

2 結果

2.1 病理質控行常規HE染色，同一患者超聲快速石蠟切片組織結構清晰，染色對比鮮明，與常規石蠟切片質量差異無顯著性，兩種HE切片的形態學結果一致，病理診斷為GIST，鏡下腫瘤細胞的比約占整張切片的60%(圖1)。

AB

圖1胃腸道間質瘤標本鏡下所見：A.超聲快速石蠟處理；B.常規石蠟處理

2.2 核酸的濃度和純度超聲快速石蠟處理的組織和常規石蠟處理的組織提取核酸濃度和純度均可以滿足下游測序的要求，兩者差異無顯著性(P>0.05，圖2)。

2.3 測序結果在18例GIST中，超聲石蠟Sanger測序檢測的結果中，C-Kit 11號外顯子基因突變16例，PDGFRA基因18號外顯子突變2例(表1)。同一患者經Leica常規脫水機石蠟包埋處理的組織和經HT-3型超聲波組織快速處理儀處理的組織樣本在測序片段的大小、背景熒光信號值、正常熒光信號峰和突變熒光信號峰上與常規石蠟樣本無明顯差異(圖3、4)。18例GIST基因測序結果完全一致(表1)。

圖2 超聲快速石蠟處理和常規石蠟處理的胃腸道間質瘤標本提取的核酸濃度(A)和純度(B)

圖3 胃腸道間質瘤標本超聲快速石蠟基因檢測：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

圖4 胃腸道間質瘤標本常規石蠟基因檢測：NM_000222.2: c.1679T>A(p.V560D)

3 討論

GIST是消化道的一種間葉源性腫瘤，約占全部胃腸道腫瘤的2%[3]。在近20年的研究中，GIST已經成為精準醫學時代針對特定基因的靶向治療的成功范例，靶向藥物伊馬替尼(Imatinib)對C-Kit基因11號外顯子突變的患者療效最佳[4]。另外，在病理診斷中，對于部分形態學符合間質瘤梭形細胞或上皮樣細胞特點、而免疫組化標記CD117和DOG1雙陰性或只有一個指標陽性的病例，若Sanger測序中C-Kit和PDGFRA基因突變陽性，病理醫師可依據分子檢測的結果診斷為GIST[5-6]。因此在胃腸道組織中進行Sanger測序檢測C-Kit和PDGFRA基因突變狀況不僅可以預示患者對靶向藥物的療效，還可以幫助病理醫師輔助鑒別診斷GIST[6]。

表1 C-Kit(NM_000222.2)和PDGFRA(NM_006206.4)基因突變的檢測結果

早期的GIST絕大部分病灶較小且患者無臨床癥狀，很多是通過體檢或活檢偶然發現[3-4]。在病理科對活檢組織進行超聲快速石蠟制片廣泛應用的今天，有部分的胃腸道活檢組織形態學觀察懷疑是GIST但免疫組化標記CD117和DOG1雙陰性或只有一個指標陽性時，可以直接使用超聲快速石蠟制片的活檢標本進行C-Kit和PDGFRA基因突變的檢測以輔助診斷GIST。臨床需要考慮使用Imatinib治療時，需要先明確C-Kit和PDGFRA基因的突變狀態，這種情況下也可以選用超聲快速石蠟處理的標本。

常規石蠟組織是新鮮標本經10%中性福爾馬林固定6～24 h，再經過由低至高各級濃度的乙醇逐級脫水，二甲苯透明以及浸蠟等程序制成，該流程耗時10～20 h。目前HE和分子病理的診斷標準均是根據組織經常規石蠟包埋制片而制定的。超聲快速石蠟是病理技術中的特殊領域，應用環保型生物組織處理試劑結合HT-3處理儀處理病理組織是利用超聲原理，在處理液中快速振蕩病理組織和有機溶劑，實現周期性縮張的效果，進而提高分子運動的速率，加速液體交換，使得細胞滲透性、溶劑分子穿透力顯著增強，最終實現病理組織的快速處理和診斷。該方法操作簡便、安全可靠、省時省力，僅需30 min左右，3個步驟就可完成脫水、透明和浸蠟的全部流程，與常規石蠟制片相比雖然可以大大縮短制片時間[1-2]。但由于在脫水過程中超聲快速石蠟組織未經10%中性福爾馬林充分固定，用了環保型生物組織處理試劑結合超聲波的作用處理組織。在分子檢測中其核酸質量和基因檢測結果與常規脫水組織是否一致，目前還尚無大量文獻報道。

在超聲快速石蠟組織脫水過程中所用環保型生物組織處理試劑大多是醇性試劑，能有效保存核酸成分，而且Sanger測序檢測方法對核酸的質量和濃度的要求比較高，本實驗證實超聲快速石蠟組織脫水過程中超聲波和生物組織處理試劑對核酸的質量和濃度無影響，且不影響下游的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測的結果。在臨床只有超聲快速石蠟標本的情況下，可以用超聲快速石蠟組織行GIST的C-Kit和PDGFRA基因突變檢測，以便輔助診斷和預示靶向治療效果。需要注意的是超聲快速脫水的組織取材大小不能過厚，以免組織脫水不徹底影響制片質量和蠟塊的保存，另外在提取核酸時盡量選擇已通過CFDA認證的商品化的核酸提取試劑盒。