免疫組化雙重標記聯合特殊染色技術應用于膠質瘤血管新生的分析

匡曉燕，張 藝，申騰飛，蔣雪峰

膠質瘤是好發于成人的原發性中樞神經系統腫瘤，約占惡性腦腫瘤的81%[1]。血管新生化是膠質瘤，尤其是膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)的突出組織病理學特征，且與其侵襲性和臨床不良預后密切相關[2]。因此，探尋膠質瘤中特殊的促血管新生因子，對于研發阻斷腫瘤源性血管發生的精準治療策略，改善這類血管化腫瘤的臨床療效，顯得尤為重要。本實驗聯合應用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)雙重標記和過碘酸雪夫(periodic acid-Schiff, PAS)特殊染色技術，發現膠質瘤細胞內生性的一種生長因子——神經膠質成熟因子-β(glia maturation factor-β, GMF-β)的表達與腫瘤血管新生的相關性。

1 材料與方法

1.1 樣本收集2006年1月～2009年12月陸軍軍醫大學(原第三軍醫大學)西南醫院病理科存檔的50例人GBM標本，病理診斷皆根據WHO(2016)中樞神經系統腫瘤分類標準再次明確。

1.2 免疫組化標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后切片備用。(1)單標染色：參照EnVision試劑盒(丹麥Dako公司，K5007)兩步法操作，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min，之后DAB顯色呈棕黃色。(2)雙標染色：應用DouSP雙標試劑盒(KIT-9999，福州邁新公司)，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。第一輪標記用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍(BCIP/NBT)顯色呈藍黑色，第二輪標記用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色呈鮮紅色。如果雙重標記后PAS呈紫紅染色，則用DAB棕黃顯色替代AEC的紅色。單標和雙標染色均設置同型對照和磷酸鹽緩沖液空白對照。

所用一抗包括：兔抗人GMF-β多克隆抗體(NBP1-89755；稀釋比1 ∶200，美國Novus公司)、兔抗人GFAP多克隆抗體(NB300-141；稀釋比1 ∶1 000，美國Novus公司)，同型對照為兔IgG。鼠抗人CD31單克隆抗體(NB600-562；稀釋比1 ∶10，美國Novus公司)，同型對照為鼠IgG1κ。GMF-β表達水平通過半定量IHC-score評分法[3]評估。微血管的判定和計數參照Weidner標準[4]，低倍鏡下篩選3個血管最豐富的腫瘤區域，高倍鏡下(400×)觀察，凡是孤立存在的CD31陽性微血管，包括CD31陽性的單個或成團細胞，皆納入微血管計算，取3個視野的平均值即為該樣本的微血管密度(microvessel density, MVD)值。膠質瘤細胞穩定表達而血管內皮不表達的神經膠質分化標志物GFAP，作為瘤細胞表達的陽性對照、血管內皮表達的陰性對照。

1.3 PAS特殊染色采用PAS染色試劑盒(MST-8038，福州邁新公司)，過碘酸染色10 min，水洗之后，Schiff氏液染色10～20 min，傾去染色液，直接滴加偏重亞硫酸鈉作用1 min(2次)。

1.4 統計學分析所有數據采用GraphPad Prism 6.02軟件進行統計學分析，選用線性回歸模型分析膠質瘤組織中GMF-β表達與MVD的關系，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞和血管內皮中GMF-β的表達(1)IHC單標：GMF-β的表達定位于細胞質。單標染色檢測發現，不僅腫瘤細胞中存在GMF-β的表達，在血管腔面也有GMF-β陽性著色(圖1A)。(2)IHC雙標：為進一步驗證GMF-β亦表達于血管內皮，實驗采用雙標染色技術。對照組GFAP/CD31中，GFAP僅表達于腫瘤細胞，不表達于CD31陽性的血管內皮中(圖1B)。而實驗組GMF-β/CD31雙標染色結果明確顯示，CD31陽性血管內皮中也存在GMF-β的表達，尤其是在具有腫瘤微血管構筑表型異質性(tumor microvascular architecture phenotype heterogeneity, T-MAPH)的血管叢中，GMF-β強陽性更多見(圖1C、D)。另外，還觀察到某些共表達GMF-β和CD31的散布間變瘤細胞簇(圖1E)。(3)IHC雙標+特殊染色：GMF-β/CD31雙標套染PAS的結果顯示，除了CD31標記血管壁上有PAS陽性基膜成分，在某些GMF-β陽性瘤細胞構成的血管腔樣結構外圍，亦檢測到PAS陽性基膜樣物質沉積(圖1F)。

2.2 腫瘤細胞和血管內皮中GMF-β表達與MVD的關系50例GBM中，腫瘤細胞GMF-β表達的IHC評分與MVD之間存在顯著正相關(r=0.458 8，P<0.001，圖2A)，而血管內皮GMF-β表達的IHC評分與MVD亦呈正相關，且相關性更顯著(r=0.667 6，P<0.000 1，圖2B)。

3 討論

組織形態學特征與分子檢測相結合的“整合診斷”(integrated diagnosis)，在腫瘤病理學研究中具有重要意義[5]。與其它分子生物學技術相比，IHC技術具有在組織原位將功能蛋白表達與組織形態學變化有機結合的優勢，且便于大樣本分析。與傳統IHC單標相比，雙重標記可在同一張組織切片上同時顯示兩種蛋白表達的相關性，已應用于腫瘤侵襲檢測、復發風險、預后評估等多方面的研究領域[6-7]。

ABCDEF

圖1A.GMF-β單標：瘤細胞陽性，血管腔面陽性著色(箭頭)；B.對照組雙標：瘤細胞GFAP陽性(紅箭頭)，CD31陽性血管(黑箭頭)； GMF-β/CD31雙標：腎小球樣(C)、樹枝樣(D)血管叢中GMF-β的表達，瘤細胞共表達GMF-β和CD31(E)，紅、黑箭頭分別示GMF-β、CD31陽性；F.GMF-β/CD31/PAS三重染色，黃、黑、紅箭頭分別示GMF-β、CD31、PAS陽性

圖2 膠質母細胞瘤中GMF-β表達水平與MVD的相關性：腫瘤細胞(A)、血管內皮(B)中GMF-β表達評分與MVD之間呈正相關

“BCIP/NBT+AEC”雙標顯色體系，應用于腫瘤血管新生的組織學研究，具有獨特的優點：(1)先用堿性磷酸酶顯色劑BCIP/NBT呈現的藍黑色突出顯示血管輪廓，后用辣根過氧化物酶顯色劑AEC使得血管新生相關因子呈鮮紅色。(2)兩種著色反差大、對比鮮明，利于直觀、便捷地觀察候選因子的表達定位和表達強弱與腫瘤血管之間的關系。當然，這套顯色體系也有一定的應用局限性。其中，過氧化物酶與底物AEC反應形成的紅色沉淀，可溶于有機溶劑，而且褪色較快，因此需用水性封片劑封片，并及時觀察、攝像。另外，對于細胞核表達的相關因子，需應用BCIP/NBT顯色時，后續應注意把控蘇木精輕度復染，以免BCIP/NBT與蘇木精的著色效果混淆。

近年來，其它研究組對IHC也做出了相應的改進[8-9]。針對“BCIP/NBT+AEC”顯色體系的局限性，以及套染PAS的技術需求，作者采取的改進措施是，將第二輪標記時與過氧化物酶反應的底物AEC替換為DAB。如此，第二標志物呈現DAB的棕黃顯色，與后續PAS紫紅染色之間的對比度增大。“BCIP/NBT+DAB+PAS”三重染色的切片經二甲苯透明和中性樹膠封固，可長期保存切片染色結果。

本實驗設計優化的組織化學三重染色技術，應用于膠質瘤血管新生的研究。已知GMF-β的主要生理功能是促進神經膠質分化，基于神經分化和血管生長之間交互調控、協同促進的機制[10]，我們探討GMF-β是否具有促進膠質瘤源性血管發生的潛在作用。本實驗結果顯示，GMF-β在腫瘤細胞和血管內皮中均表達，且皆與MVD呈正相關；GMF-β優勢表達于具有構筑表型異質性的腫瘤血管上；某些GMF-β陽性瘤細胞表達內皮特異標志物CD31，或者構成血管腔樣結構(PAS陽性)。上述發現初步提示，GMF-β參與促進膠質瘤血管新生，并可能介導GBM細胞形成血管擬態(vascular mimicry, VM)樣結構或發生內皮樣分化，為膠質瘤細胞參與構成新生血管的理論[11]提供新的實驗依據。本組的后續體內外實驗也進一步驗證了GMF-β促進膠質瘤源性血管形成的作用[12]，該因子有望作為膠質瘤的獨立預后指標以及抗血管治療靶點。總之，發揮IHC雙重標記和特殊染色的技術優勢，有利于發現新的促腫瘤血管生成因子，對于膠質瘤和其它血管化腫瘤的研究，具有特別的應用意義。