基于共價有機骨架修飾電極的苯并芘電化學發光傳感器

孫 苗，徐文清，王 黎，龐月紅

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

多環芳烴(PAHs)是一類由兩個及以上苯環稠合而成的持久性有機污染物，極易在食品加工過程(如燒烤、烘烤、熏烤、煎炸等)中產生[1-2]，對人體有非常強的致癌、致畸和致突變毒性[3-4]。苯并芘(BaP)是PAHs中致癌性最強的一種，是世界衛生組織認證的三大致癌物之一[5-7]，常作為PAHs的指標化合物。因此，對食品中BaP含量的測定具有非常重要的意義。

目前，食品中BaP的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8-10]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[7,11]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[12-14]、酶聯免疫吸附法(ELISA)[15-16]、熒光分析法和電化學方法[5,17]等。其中電化學發光法(ECL)作為一種新型的電化學及發光分析方法，由于具有儀器設備成本低、操作簡單、快速、靈敏度較高等特點而被廣泛應用于食品及環境監測等領域[18-20]。

共價有機骨架(COFs)是一類由輕元素(如H、B、C、N和O等)通過強共價鍵連接的結構高度有序的新型晶型多孔材料，與其他材料相比，具有孔徑可調、孔隙率持久、熱及化學穩定性較高、比表面積較大、可功能化等特點，而被廣泛應用于氣體儲存、催化、樣品前處理、色譜分析等領域[21-22]。近年來，已有將COFs材料應用于電化學及傳感方面的研究報道，如孫淑敏等[23]合成三嗪基共價有機骨架/石墨烯復合材料，并研究其用作超級電容器電極材料的電化學性能；Banerjee 課題組[24]通過信號開、關兩種傳感機制將2D COF 納米片用于硝基芳香化合物的快速、高靈敏檢測；Zhang等[25]通過將制備的TAPB-DMTP-COFs復合材料與金納米結合構成了一種檢測綠原酸的電化學傳感器。CTpPa-2是由功能化的1,3,5-三醛基間苯三酚(CTp)與2,5-二甲基對苯二胺(Pa-2)通過縮合反應形成的一種亞胺類COF材料[26-27]，具有較好的結晶度、較大的比表面積、良好的穩定性，并含有豐富的共軛結構，其孔徑約為12 ?，略大于BaP的分子直徑(11.5 ?)。本文通過滴涂法將功能化的共價有機骨架材料CTpPa-2修飾至電極表面，建立了一種新型的基于共價有機骨架的BaP電化學發光傳感器，并將其用于烤肉樣品的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電化學發光分析系統包括電化學分析儀和多功能化學發光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司)；LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；FE20K精密pH計(Mettler-Toledo Instr Ltd)；Milli-Q Integral Cabinet 3超純水系統(美國密里博公司)。

魯米諾(BBI生命科學有限公司);苯并芘(上海百靈威科技有限公司);過氧化氫、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四氫呋喃、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸(國藥集團化學試劑有限公司);所有試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CTpPa-2修飾電極的制備玻碳電極(GCE)的預處理：依次采用3 μm和0.05 μm Al2O3粉末對裸玻碳電極研磨拋光至鏡面，然后在硝酸水溶液(1∶3,體積比)、乙醇和水中各超聲30 s、1 min、1 min，氮氣吹干后，采用循環伏安法(CV)以0.03 V/s的掃速在10 mL 1 mmol/L鐵氰化鉀的電解液中進行掃描，當掃描的氧化峰和還原峰峰電位差(ΔEp)間隔小于0.1 V時，表明電極潔凈度較好。再經水沖洗，氮氣吹干備用。

CTpPa-2/GCE制備：將5.0 mg共價有機骨架材料CTpPa-2溶于5.0 mL乙醇溶液，超聲振蕩2 h后，與1%Nafion的乙醇溶液以1∶1體積比進行混合并超聲至分散均勻。取5.0 μL混合溶液均勻滴于經預處理的電極上，待電極表面晾干，標記為CTpPa-2/GCE。

1.2.2 電化學測試及電化學發光檢測采用三電極體系，以CTpPa-2/GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極，在1 mmol/L鐵氰化鉀電解液中以0.03 V/s的掃速進行CV掃描，測試修飾電極的電化學性能。以含20 nmol/L的魯米諾，pH為8.5的磷酸緩沖液(PBS)(2 mL磷酸緩沖溶液、20 μL過氧化氫溶液、20 μL魯米諾)為電解液，對CTpPa-2/GCE進行差分脈沖法掃描。

在電化學發光檢測過程中，以CTpPa-2/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極，并以上述PBS溶液為電解液。設置循環伏安參數為：初始電位0 V，高電位0.8 V，低電位0 V，掃速100 mV/s，光電倍增管為800 V。體系置于暗箱中進行電化學發光反應，同時記錄其循環伏安特性和電化學發光強度。于魯米諾的反應電位處觀察峰形，測試魯米諾的電化學發光響應程度。

1.2.3 樣品處理烤肉樣品購自當地燒烤攤，均質后，準確稱取30 g，于90 mL乙腈-水(9∶1，體積比)混合溶液中依次超聲、100 ℃水浴提取1 h，待冷卻浸泡1夜后，離心過濾，收集上清液，經濾膜過濾后備用。樣品溶液經0.1 mol/L氫氧化鈉調至pH 8.5后代替上述電解液中的磷酸緩沖溶液進行電化學發光測定。

1.2.4 高效液相色譜法測定參照國家標準GB 5009.27-2016[28]，采用高效液相色譜法對實際樣品中的BaP進行檢測。色譜條件為：C18色譜柱，流動相為88%的乙腈水溶液，流速1.0 mL/min，激發波長384 nm，發射波長406 nm，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 BaP電化學發光傳感器構建

BaP電化學發光傳感器的構建如圖1所示，通過簡單的滴涂方式將共價有機骨架材料CTpPa-2修飾至潔凈電極表面，然后在魯米諾-過氧化氫為電解液的三電極體系中分別考察裸GCE及CTpPa-2/GCE對魯米諾電化學發光的響應情況。由差分脈沖曲線(圖2A)可以看出，裸GCE在約0.5 V電位處的氧化峰電流為1.18 μA，而CTpPa-2/GCE的電流值為1.57 μA，說明CTpPa-2材料的引入能夠增強電極上魯米諾的氧化還原反應，起到放大電流信號的作用。電化學發光實驗也表明，同樣在0.5 V電位處，裸GCE的電化學發光強度約為1 900 a.u，而CTpPa-2/GCE約為7 780 a.u(見圖2B)，表明經CTpPa-2修飾后電極上魯米諾的發光強度增強近4倍。這可能是由于CTpPa-2的存在不僅增大了電極的比表面積，使魯米諾與電極的接觸面積變大，且CTpPa-2本身所富含的共軛體系與魯米諾的苯環結構間產生了π-π相互作用，使魯米諾在CTpPa-2/GCE上發生了聚集，雙重作用下，導致魯米諾的電化學發光信號得到極大增強。

圖1 CTpPa-2/GCE的制備過程及檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram for preparation process and detection of CTpPa-2/GCE

圖2 GCE、CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中的差分脈沖曲線(A)和ECL響應曲線(B)Fig.2 Differential pulse curves(A) and ECL responses(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCE in luminol systema:bare GCE ;b:CTpPa-2/GCE

圖3 600 nmol/L BaP對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中ECL強度的影響Fig.3 Effect of 600 nmol/L BaP on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

從圖3可以看到，當向反應體系中加入BaP后，CTpPa-2/GCE電極上的電化學發光強度大幅度減弱，這可能是由于BaP相較于魯米諾含有更多的苯環，更易與電極表面的CTpPa-2材料結合，與魯米諾間產生了競爭作用，導致魯米諾的吸附量減少，從而造成電化學發光信號的降低。本文根據BaP的加入量與信號減弱程度的關系，構建了BaP的電化學發光傳感器。

2.2 CTpPa-2/GCE的表征

圖4為CTpPa-2/GCE在緩沖溶液中的恒流充放電曲線(A)及循環伏安曲線(B)，由圖4A可看到，CTpPa-2能夠較快進行完全的充放電，而由圖4B可觀察到，在-0.1 V左右有1個還原峰，但并無氧化峰出現，表明反應過程不可逆。上述電化學測試均表明該材料具有良好的電化學性能。

采用掃描電子顯微鏡(SEM)和循環伏安法對CTpPa-2/GCE進行表征(圖5)。由SEM圖可以看出，裸GCE的表面光滑平整(圖5A-a)，而經CTpPa-2材料修飾后，電極表面變得粗糙，且呈現褶皺的形態，從而提供了較大的比表面積(圖5A-b)，表明CTpPa-2已成功修飾至電極表面。

圖4 CTpPa-2/GCE在0.32 A/g電流密度下的恒流充放電曲線(A)，以及GCE與CTpPa-2/GCE的循環伏安曲線(B)Fig.4 Galvanostatic charge/discharge curve of CTpPa-2/GCE at a current density of 0.32 A/g (A),and CV curves of bare GCE and CTpPa-2/GCE (B)a:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

分別將裸GCE及CTpPa-2/GCE浸入1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，掃描其循環伏安圖(圖5B)。可觀察到，相較于裸GCE，CTpPa-2/GCE的氧化、還原峰電流值分別由-13.17 μA和12.95 μA上升至-14.58 μA和15.52 μA，表明經過CTpPa-2修飾后電極的電化學性能較裸GCE更佳。

圖5 裸GCE 及CTpPa-2/GCE表面的SEM圖(A)，以及GCE和CTpPa-2/GCE在1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的循環伏安曲線(B)Fig.5 SEM images(A) and CV curves in 1 mmol/L potassium ferricyanide solution(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCEa:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

圖6 pH值對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中 ECL強度的影響Fig.6 Effect of pH value on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

2.3 電化學發光檢測條件的優化

為使CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中獲得更強的電化學發光信號，以實現對BaP更靈敏的檢測，本實驗分別對電解液pH值及掃描速率進行了優化。

圖7 不同濃度BaP對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中ECL強度的影響Fig.7 Effect of different BaP concentrations on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system BaP concentration (a-g):0,50,200,300,400,500,600 nmol/L;insert:linear relationship between ECL intensity and BaP concentration

2.3.1 pH值對電化學發光強度的影響大量研究表明，魯米諾在中性和堿性體系中才具有良好的電化學發光性能。因此本實驗在pH依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的電解液中考察了CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中的電化學發光強度。由圖6可以看出，在pH 7.0～8.5范圍內，電化學發光強度逐漸增強。此后，隨著pH值的進一步增大，發光強度呈下降趨勢。因此，本實驗選擇魯米諾體系的最佳pH值為8.5。

2.3.2 掃描速率對電化學發光強度的影響電化學發光的發光效率與激發態物質的產生和湮沒比率有關，而激發態物質發生電化學反應的效果與掃描速率的快慢有關，過慢或過快的掃描速率均會導致發光強度的降低。因此本實驗在掃描速率為0.05～0.12 V/s范圍內對電化學發光強度進行考察。結果顯示，隨著掃描速率的不斷增加，電化學發光強度逐漸增大并在0.10 V/s處達到最大值，隨著掃描速率的繼續增加，電化學發光強度逐漸減弱。因此，本實驗選擇0.10 V/s作為后續實驗的掃描速率。

2.4 BaP的電化學發光檢測

在最優實驗條件下，向含魯米諾的PBS溶液中加入不同濃度的BaP，依次測定其電化學發光強度(圖7)。結果顯示，隨著BaP濃度的增加，電化學發光強度逐漸降低，且發光強度與加入的BaP濃度在50～600 nmol/L范圍內呈良好的線性關系(r2= 0.995 1)，檢出限(S/N=3)為5.60 nmol/L。

2.5 電化學發光傳感器的穩定性與抗干擾性

發光體系和修飾電極的穩定性有助于構建性能優異的電化學發光傳感器，因此本實驗考察了該電化學發光傳感器的穩定性。將所制備的CTpPa-2/GCE在含魯米諾的PBS溶液中連續掃描10圈后，電化學發光強度值為初始響應值的99.7%。將修飾后的電極于室溫干燥環境中放置7 d后，考察電極放置前后對BaP響應值的變化。結果顯示，放置后的響應值為初始響應值的91.5%。實驗結果表明本文制備的CTpPa-2/GCE具有很好的穩定性。

要實現食品中BaP的檢測，需排除能與BaP共存且性質相似物質(如脂溶性抗氧化劑)的干擾，為此，進一步考察了電極的抗干擾性。食品中常見的該類似物質有沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、維生素E等。本實驗分別將0.1 mol/L的PG、TBHQ及維生素E與BaP一同放入電解液中進行電化學發光檢測，實驗結果顯示BaP的相對電化學發光強度值分別變化了2.4%、3.9%和5.0%。說明上述抗氧化劑未對BaP的電化學發光檢測產生明顯干擾，本文制備的電化學發光傳感器具有較好的抗干擾性。

2.6 烤肉樣品中BaP的測定

將烤肉樣品按照“1.2.3”進行處理后，分別用本文提出的電化學發光傳感方法和高效液相色譜法對實際樣品中的BaP進行6次平行測定，結果如表1所示。對比結果顯示，本方法測定實際樣品中BaP含量的結果與HPLC法的測定結果相近，表明本方法對實際樣品中BaP的檢測具有較好準確性、有效性和可行性。

表1 烤肉中BaP的ECL和HPLC測定結果(n=6)Table 1 Detection results of BaP in roast meat with ECL and HPLC methods(n=6)

3 結 論

本文通過將共價有機骨架材料CTpPa-2修飾至電極表面，并與魯米諾-過氧化氫體系相結合，構建了一種BaP的電化學發光傳感器并成功運用于實際樣品中BaP的檢測。該方法操作簡單快速、成本低廉，且具有較好的穩定性與抗干擾能力，以及良好的應用前景。