固相萃取/氣相色譜-質譜法對土壤中有機氯農藥的分析及基質效應研究

劉玲玲，孟甜甜，董希良，任 偉，張利鈞

(濟南市環境研究院，山東 濟南 250100)

有機氯農藥(Organochlorine pesticides，OCPs)是公認的環境中毒性最大的一類持久性有機污染物和疏水性有機污染物，被全面禁用后，其在環境介質中的濃度顯著下降，但低水溶解性和強疏水性的特點使之易吸附在懸浮顆粒物上，并最終累積在沉積物和土壤中[1]。土壤作為OCPs的主要匯和儲蓄庫[2]，不僅具有較強的滯留能力，而且還可作為其他介質的污染源將其重新排放到大氣、地下水和生物體等環境中[3]，并通過生物積累和放大效應對生態系統和人體健康造成廣泛而持久的影響[4]。如已禁用的滴滴涕、六六六等有機氯農藥因結構穩定，能夠長期殘留在土壤中，目前仍被頻繁檢出[5]。因此，建立一種快速、準確檢測土壤中有機氯農藥的方法尤為重要。

土壤中農藥殘留檢測主要包括樣品前處理和儀器分析兩個部分，其中前處理包括提取和凈化兩種方式，提取方式主要為索氏提取(Soxhlet extraction)[4]、超聲提取(Ultrasound extraction)[6]、微波提取(Microwave extraction)[7]、快速溶劑萃取(Accelerated solvent extraction,ASE)[8]及QuEChERS方法[5]等，ASE因具有提取速度快、溶劑消耗量少、自動化程度高等優勢，受到越來越多研究工作者的青睞[8-9]，國內外很多標準方法也優先推薦該方式[10-11]。凈化方式主要有固相萃取(Solid phase extraction,SPE)凈化[9]、凝膠色譜凈化(Gel permeation chromatography，GPC)[12]方式。其中GPC可同時對多種物質凈化，但溶劑消耗量大、耗時較長，不適合批量分析。而SPE凈化溶劑消耗量小、可自動化批量處理、操作簡單。有機氯農藥檢測技術主要有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[13]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[8]、液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[5]等，GC-MS由于分析速度快、定性能力強，近年來得到廣泛應用[13-14]。

基質效應是農殘檢測中普遍存在的現象，這主要取決于農藥的種類、樣品類型、檢測儀器原理等多個方面。農藥的極性及熱穩定性是影響基質效應的重要因素，同一農藥在不同樣品中的基質效應也有差異[15]，GC-MS檢測時的基質效應主要是農藥與硅醇基及其與玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所致[16]。對于不同的農藥及樣品類型，常用的補償基質效應方法有基質凈化法[17-18]、同位素標記法[19-20]、基質匹配校準法[21-22]、加入分析保護劑法[23-24]，而GC-MS檢測中常采用優化進樣技術的方式進行基質補償[13]，實際研究工作中常將多種補償方法相結合。基質匹配校準法因并未減弱基質效應，且無法獲得適用于所有基質的統一空白基質，故存在一定缺陷。基質凈化法則從根本上消除可能產生基質效應的共提物，凈化效果越好，待測溶液與標準溶液類型越相近，檢測結果受基質效應影響的程度就越小，在各種凈化方式中，SPE小柱凈化效果更為理想[15]。優化進樣技術無需復雜的操作即可達到降低基質效應的目的。目前農殘基質效應的研究主要集中在農產品中[13,18-21,23-24]，而對土壤中有機氯農藥基質效應的研究報道較少。本研究通過分析不同SPE凈化溶劑和不同進樣方式對基質效應的補償作用，篩選出最優預處理方法，旨在為我國土壤環境中OCPs的快速、準確檢測提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B/5977B GC-MS儀(美國安捷倫公司)；ASE350快速溶劑萃取儀(美國賽默飛公司)；M10平行蒸發濃縮儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)；HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫公司)；Alpha 1-4LDplus冷凍干燥儀(德國Christ公司)；RM200土壤臼式研磨儀、AS200土壤篩分儀(德國萊馳公司)；Milli-Q超純水機(德國默克公司)。

正己烷、丙酮、二氯甲烷(色譜純，美國Tedia公司)；弗羅里硅土小柱(500 mg/6 mL，美國安捷倫公司)；無水硫酸鈉及石英砂顆粒(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；硅藻土顆粒(30～40目，美國賽默飛公司)。

α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDT、p,p′-DDD、六氯苯、α-氯丹、γ-氯丹、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、α-硫丹、β-硫丹、滅蟻靈、七氯、環氧化七氯、異狄氏劑醛、硫丹硫酸酯、異狄氏劑酮、甲氧滴滴涕23種有機氯農藥混標(質量濃度均為1 000 μg·mL-1，美國AccuStandard公司)；標準替代物：四氯間二甲苯、氯茵酸二丁酯和十氯聯苯的混標(2 000 μg·mL-1)及內標(五氯硝基苯,1 000 μg·mL-1)均購于美國o2si公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品采集與制備采集表層土壤(0～20 cm)至潔凈的棕色玻璃瓶中，將采樣瓶裝滿、裝實，密封，于4 ℃下避光冷藏保存，保存時間不超過10 d。取適量樣品混勻，經-55 ℃冷凍干燥后，用土壤臼式研磨儀研磨，過250 μm金屬網篩混勻后，置于棕色瓶中備用。

1.2.2 樣品提取與凈化提取：在萃取腔(34 mL)底部放置專用的玻璃纖維濾膜，濾膜上鋪一層硅藻土顆粒。準確稱取20.00 g樣品，均勻混入硅藻土顆粒，同時加入15 μL 200 μg·mL-1替代物的混標中間液，用硅藻土填滿萃取池，于加速溶劑萃取儀中萃取，萃取溶劑為正己烷∶丙酮(體積比1∶1)；載氣(高純氮氣)壓力：1.0 MPa；萃取溫度：100 ℃；萃取池壓力：10 MPa；預加熱平衡時間：3 min；靜態萃取時間：5 min；放氣時間：2 min；循環次數：2次；總萃取時間：22 min。萃取液收集于250 mL接收瓶中，待凈化。

凈化：向弗羅里硅土小柱中加入無水硫酸鈉及經硝酸處理過的銅粉，分別用5 mL二氯甲烷、10 mL正己烷預淋洗弗羅里硅土小柱，然后將1 mL提取液移入柱內，用10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)進行洗脫，待洗脫液全部流出至濃縮杯中后，將其濃縮至約1 mL，再加入3 mL正己烷清洗濃縮杯內壁，再濃縮至1 mL以下，將溶劑完全轉換為正己烷。加入8 μL內標物并準確定容至1.0 mL，待測。

1.3 GC-MS條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：HP-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃，脈沖不分流進樣，脈沖壓力275.8 kPa；進樣量：2.0 μL，柱流量：1.0 mL/min(恒流)；程序升溫：初始溫度120 ℃，保持1 min；以12 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以7 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，再以1 ℃/min升至250 ℃，保持2 min，最后以15 ℃/min升至300 ℃，保持2 min。

圖1 23種有機氯、3種替代物及1種內標標準品的總離子流圖Fig.1 TIC of 23 organochlorine pesticides,3 surrogate standards and internal standard the number 1-23 were the same as those in Table 1

1.3.2 質譜條件離子源：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度：230 ℃；掃描方式：選擇離子掃描模式；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲時間：5 min；目標物質譜參數見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優化

本實驗采用HP-5ms毛細管色譜柱對目標物進行分離，通過全掃描(Scan)和選擇離子監測(SIM)模式進行測定，選擇豐度高、干擾低的特征離子為定量離子，豐度較高、干擾較低的2個特征離子為定性離子。23種有機氯的SIM離子及保留時間見表1，總離子流色譜圖如圖1所示。

表1 23種有機氯農藥保留時間與SIM 離子Table 1 Retention times and selected-ion monitoring ions of 23 organochlorine pesticides

2.2 前處理條件的優化

回收率主要取決于ASE提取溶劑及凈化時洗脫溶劑的選擇。因此，采用分步加標的方式考察了加速溶劑萃取及凈化步驟的回收率。

2.2.1 ASE提取溶劑的確定本研究參考環境標準方法《土壤和沉積物 有機氯農藥的測定 氣相色譜-質譜法》(HJ835-2017)[25]，采用正己烷∶丙酮(體積比1∶1)對添加4 μg·mL-1有機氯混標的硅藻土進行提取，計算其回收率。結果顯示，23種有機氯農藥的回收率為59.7%～114%，可滿足分析要求。因此，實驗選擇正己烷∶丙酮(體積比1∶1)為ASE的提取溶劑。與宋曉娟[8]、陶鑫[26]、黃志[27]等的研究結果一致。

2.2.2 SPE洗脫溶劑的選擇實驗考察了20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)、20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)、10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑時對回收率的影響。結果顯示，20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)對19種(占總檢測有機氯農藥的82.6%)有機氯農藥的回收率較高(>80%)，在該洗脫劑條件下，Kruskal-Wallis(K-W)非參數檢驗結果表明，17種有機氯農藥的回收率顯著高于其它兩種洗脫劑的回收率(p<0.05)，4種農藥的回收率則顯著低于其它2種洗脫劑，介于40.9%～63.2%之間，六氯苯和甲氧滴滴涕回收率差異則不顯著。10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑的回收率介于其它兩種洗脫劑之間，回收率為76.7%～121%。20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)洗脫時的回收率為62.1%～90.9%，顯著低于前兩種(p<0.05)。為保證大部分有機氯農藥有較好的回收率，選擇10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為凈化的洗脫劑。

2.3 基質效應

基質效應(ME)的計算公式采用公式[28]：ME=(Am/As-1)×100%，式中Am為基質中農藥標準溶液的峰面積，As為純溶劑中農藥標準溶液的峰面積。|ME|<20%為弱基質效應，無需采取補償措施；20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應，|ME|>50%為強基質效應，須采取措施補償基質效應[29]。本研究比較了同為4 μg·mL-1的溶劑標準溶液與土壤基質匹配標準溶液的響應值，研究發現，p,p′-DDD、o,p′-DDT、異狄氏劑醛、異狄氏劑酮呈現中等程度的基質效應，p,p′-DDT、異狄氏劑、甲氧滴滴涕則存在強基質效應，需采取補償措施，因此分析了基質凈化法和不同進樣方式對基質效應的補償作用。

2.3.1 不同洗脫溶劑對基質效應的補償作用洗脫溶劑是凈化條件中最主要的影響因素，不同洗脫溶劑對基質效應的補償作用也不同。本研究分析了20 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)、20 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)、10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9) 3種洗脫溶劑對基質效應的影響。結果表明，采用凈化措施后，大部分有機氯農藥的ME均有所降低，且以10 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比1∶9)+10 mL丙酮∶正己烷(體積比1∶9)為洗脫劑時對中、強基質效應農藥的基質補償效果最好，18種有機氯農藥(占比78.3%)的基質效應在20%以內。其中，p,p′-DDD、異狄氏劑酮由中等程度基質效應降為弱基質效應，p,p′-DDT、甲氧滴滴涕由強基質效應降為中等程度基質效應。

2.3.2 進樣方式對基質效應的影響在氣相色譜-質譜檢測過程中，不同的進樣模式對基質效應的影響有著巨大的差別[15]。非脈沖和脈沖不分流進樣是GC-MS中最常用的進樣技術，在脈沖不分流進樣方式中，脈沖壓力是最重要的參數[13]。按照儀器條件對凈化后的土壤基質標準溶液進行測定，考察了非脈沖不分流進樣和脈沖不分流進樣對基質效應的影響。結果表明，脈沖進樣的ME整體上較非脈沖進樣低，所有農藥的|ME|均在50%以內，不存在強基質效應。賀利民等[30]的研究也指出，脈沖不分流進樣技術能夠大大減少基質效應。

在脈沖進樣方式中，脈沖壓力為103.4、172.4、275.8 kPa時的|ME|值在20%以內的農藥數量分別為18、19、23，由此可見，隨著柱頭壓力的增大，其對應的基質效應整體呈減弱趨勢，特別是對異狄氏劑和滅蟻靈的基質減弱作用較為明顯。這是因為隨著進樣過程中流速的增加和進樣口壓力的增大，樣品在進樣口的停留時間減少[30]，減少了目標物與襯管中活性位點的作用時間，從而降低了基質效應。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線及檢出限在優化凈化條件和進樣方式下，23種有機氯農藥均表現為弱基質效應，可采用溶劑配標法進行定量，用正己烷將23種有機氯農藥及替代物混標分別稀釋成0.4、1、2、3、4、6、8、10 μg·mL-1，均加入8 μL內標物(1 000 μg·mL-1)，最終質量濃度為8 μg·mL-1。通過保留時間和NIST譜庫檢索對目標物進行定性分析，采用內標法定量。23種有機氯在0.4～10 μg·mL-1質量濃度范圍內線性良好，相關系數(r2)不低于0.999 2，校準曲線中目標物相對響應因子(RRF)的RSDRRF為0.34%～9.8%。按照《環境監測 分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168-2010)[31]中規定，方法檢出限(LOD)=3.143δ(δ為7個空白加標平行測定的標準偏差)，方法定量下限(LOQ)為4倍的LOD。本研究中23種有機氯農藥的LOD為1.0～8.6 μg·kg-1，LOQ為4.0～34.4 μg·kg-1(表2)。

2.4.2 回收率及精密度在空白土壤中分別添加20、60、100 μg/kg的23種農藥的混合標準溶液進行空白基質加標回收實驗，每個濃度平行6個，在優化條件下測定，計算各待測物的回收率及相對標準偏差(RSD)。結果顯示，23種農藥在3個加標水平下的平均回收率為46.3%～127%，RSD為0.68%～15%(表2)，回收率滿足40%～150%的要求[25]，具有良好的準確度及精密度。

表2 23 種有機氯農藥的線性相關系數(r2)、RRF的相對標準偏差(RSDRRF)、平均回收率、相對標準偏差、檢出限及定量下限Table 2 Linear coefficients(r2),relative standard deviations of RRF(RSDRRF),average recoveries,RSDs,limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of 23 organochlorine pesticides

圖2 實際土樣的色譜圖Fig.2 Chromatogram of soil sample the number 1-23 were the same as those in Table 1

2.5 實際樣品檢測

在優化條件下，采用本法對采集自濟南市某基地(36°41′10″N,117°4′45″E)的土壤樣品進行檢測，結果檢出5種農藥(圖2)，分別為α-六六六、γ-六六六、p,p′-DDE、異狄氏劑醛、p,p′-DDT，含量為3.91～11.3 μg·kg-1。

3 結 論

本文建立了一種固相萃取/GC-MS同時測定土壤中23種有機氯農藥的分析方法，并考察了凈化方式及進樣條件對基質效應的影響，該方法操作簡單、高效，可用于復雜土壤樣品的分析。