澳洲石斛花粉離體萌發液體培養基研究

夏春英 謝小敏 劉江楓 鄭誠樂

摘要：以澳洲石斛（Dendrobium kingianum）新鮮花粉為試驗材料，在單因素試驗基礎上，設計正交試驗，比較蔗糖、H3BO3、CaCl2對澳洲石斛花粉萌發的影響，旨在篩選出適合澳洲石斛花粉離體萌發的液體培養基配比，為澳洲石斛花粉離體培養及雜交育種提供參考依據。結果表明，單因素試驗中，在一定濃度范圍內的蔗糖、H3BO3、CaCl2，對澳洲石斛花粉萌發具有一定促進作用，超過一定濃度則起抑制作用;正交試驗中，蔗糖、H3BO3和CaCl2對澳洲石斛花粉萌發的影響都極顯著，適宜的花粉離體萌發培養液為10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2，花粉萌發率為37.02%。

關鍵詞：澳洲石斛;花粉;離體萌發;液體培養基

中圖分類號： S682.310.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0149-04

收稿日期：2019-03-29

基金項目：福建省福州市園林局2014年度綠化專項科研項目（編號：201404）。

作者簡介：夏春英（1996—），女，福建三明人，碩士研究生，從事花卉與景觀園藝研究。E-mail：1144179784@qq.com。

通信作者：鄭誠樂，博士，教授，從事果樹栽培生理與生化、花卉與景觀園藝、設施園藝等研究。E-mail：zcl2003@126.com。

澳洲石斛（Dendrobium kingianum）是蘭科石斛屬植物，原產于澳大利亞，生長在闊葉林的樹干上，為附生蘭。澳洲石斛植株較小，其葉莖特殊，具有根莖、直立、匍伏或具假球莖等生育形式，上部略呈回折狀，類似竹節，呈黃綠色[1];葉著生于近莖頂，2～4張葉，一般為橢圓形，與竹葉形似;花葶從葉腋抽出，花簇生，花徑2～3 cm，萼片及花瓣為紫紅色，唇瓣前端帶有紫色條斑，瓣心泛白[2]。石斛蘭是蘭科石斛屬的總稱，與卡特蘭、蝴蝶蘭、文心蘭同為世界四大觀賞洋蘭[3]。隨著人們對觀賞石斛消費需求的擴大，觀賞石斛的育種及其雜交新品種的研究越來越受關注[4]。澳洲石斛花色鮮艷，可切花觀賞，在蘭花愛好者中頗受歡迎，相關的學術研究也逐漸開展，其中，培育品種是最首要的一個方面。

花粉作為雄配子體，其質量和生活力是保證受精成功所必備的條件之一，在雜交育種工作中，具有較高生活力的花粉是確保雜交成功的關鍵，其地位舉足輕重[5-7]。蘭科植物的花粉塊狀結構為四分體，從而降低了花粉離體萌發的速率，液體培養時，在培養前將花粉加以浸泡研磨，不僅可以提高試驗效率還可提高花粉的萌發率[8]。澳洲石斛是石斛蘭中的一個新興品種，目前，國內外關于澳洲石斛的相關研究報道還比較少見。因此，本研究在前人研究的基礎上，以澳洲石斛的花粉為試驗材料，采用液體培養法，研究了不同蔗糖、H3BO3、CaCl2濃度及其正交組合對花粉萌發的影響，以期為澳洲石斛花粉生活力測定提供技術參考與試驗方法，進而為其雜交育種和繁殖生物學的深入研究提供基礎資料。

1?材料與方法

1.1?材料

本試驗于2018年1—5月進行，材料為栽培于福建省福州市于山風景區蘭花圃內的澳洲石斛，所用花粉取自澳洲石斛盛花期當天開放的新鮮花朵，09：30—10：30采集花粉（圖1右第4朵花的花粉）。

1.2?方法

1.2.1?單因素試驗

在澳洲石斛盛花期，于晴天的09：30—10：30采集澳洲石斛當天開放的花朵于濾紙上，迅速轉至實驗室條件進行下一步試驗操作。采用液體培養法，首先進行單因素試驗設計，分別對蔗糖、H3BO3和CaCl2這3個培養基組分進行研究，并作如下質量濃度梯度設置，即蔗糖為1、5、10、20、30、40、50、60 g/L，H3BO3為10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L，CaCl2為1、5、10、20、30、40、50、60 mg/L，各設置8個質量濃度梯度，并正確配制相應的液體培養基。將配制好的培養液每種取3 mL加入離心管， 然后把適量花粉團裝入離心管中并用

鑷子輕輕摩擦花粉團使花粉粒均勻分散于培養液中，在26 ℃恒溫箱中暗培養。培養36 h后取數個樣進行花粉萌發情況預觀測，培養至48 h后，將培養的花粉從恒溫箱中全部取出，用膠頭滴管取適量培養液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在生物顯微鏡4倍鏡下鏡檢，每次觀測時隨機選取10個視野，排除畸形花粉后，統計花粉萌發情況。試驗重復3次，以花粉管長度大于花粉粒直徑為標準。

花粉萌發率=萌發花粉數/花粉總數×100%。

1.2.2?正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇在單因素試驗中對澳洲石斛花粉離體萌發影響較大的蔗糖、H3BO3和CaCl2的4個質量濃度水平，采用L25（53）正交試驗設計，每個組合重復3次，以確定培養基不同組分的最佳配比，培養與檢測方法同“1.2.1”節。

1.3?數據處理

所測數據用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行統計分析。在處理正交試驗原始數據時，如果服從二項分布的百分率資料中有小于30%或大于70%的百分率，則應對資料中全部百分率數據進行反正弦轉換，然后再進行方差分析[9]。因此，由于本試驗中有許多小于30%的百分率數據，所以先對數據進行反正弦函數轉換，再用轉換后的數據進行SPSS方差分析，反正弦函數公式為x=arcsinP（其中，P為萌發率百分數）。

2?結果與分析

2.1?不同培養基組分對澳洲石斛花粉離體萌發的影響

由表1可知，隨著蔗糖、H3BO3、CaCl2這3個單因素培養基組分的質量濃度變化，花粉萌發率均呈現先上升后下降的趨勢。通過Excel和SPSS軟件對原始數據處理的結果來看，在單因素方差分析和多重比較中，蔗糖對澳洲石斛花粉萌發率的影響最明顯，當其質量濃度為10 mg/L時，萌發率與其他組均有顯著差異，萌發率為最大值17.19%;當H3BO3質量濃度為30 mg/L時，花粉萌發率最高，為1331%;CaCl2質量濃度為30 mg/L時，花粉萌發率最高，為5.13%。

2.2?最適培養基篩選

選擇在單因素試驗中對澳洲石斛花粉離體萌發影響較大的蔗糖、H3BO3和CaCl2的4個質量濃度水平，采用L25（53）正交試驗設計，尋找3因子的最佳配比（表2）。對該正交試驗反正弦函數轉換后的數據做方差分析，其中，主體間效應檢驗結果表明，蔗糖、H3BO3和CaCl2這3個因素對花粉萌發都有極顯著影響;正交方差分析的多重比較結果顯示，蔗糖30 g/L、H3BO3 60 mg/L、CaCl2 30 mg/L時的花粉萌發率與其他組合存在顯著差異，此組合在正交試驗中編號為25，萌發率為22.52%。進一步分析，花粉萌發率平方和最高值的組合為10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2，此組合在正交試驗中編號為14，萌發率最高，為37.02%，且與其他組合存在顯著差異（P<0.05），優于編號25的組合。綜合單因素試驗及正交試驗結果的方差分析和比較，得出澳洲石斛的最適培養基組合為 10 g/L 蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2。

正交試驗培養36 h后取部分樣進行花粉萌發情況預觀測，培養48 h后，在4倍顯微鏡下其萌發情況見圖2。

3?討論與結論

由于蘭科植物的花粉是4個花粉塊黏結組成的花粉團，花粉團外面包裹著類脂膜，這使得花粉萌發的速度降低，往往在研磨浸泡時也不能完全排除黏連物質對花粉萌發的影響[10]。因此本研究采用液體培養法，來提高試驗效率和花粉萌發率。其次，多數研究都發現蔗糖、H3BO3和CaCl2對蘭科植物花粉的萌發起關鍵作用，因此本試驗將蔗糖、H3BO3和CaCl2作為花粉離體萌發主要的培養基成分。

蔗糖在花粉萌發過程中，不僅作為重要的能源物質為花粉萌發提供營養，并且作為滲透物質為花粉萌發和生長起到調節滲透壓的作用，恰到好處的蔗糖質量濃度可以維持好花粉和培養基間的滲透壓，在一定程度上緩解花粉破裂，但若質量濃度過高或者過低，對花粉的萌發生長不僅沒有促進作用，在質量濃度過高時還會造成原生質脫水，反而抑制了萌發[11-13]。在本試驗中，蔗糖不是澳洲石斛花粉離體萌發所必需的成分，這一結果與雜種卡特蘭（Cattleya hybrida）[14]、聚石斛（Dendrobium lindleyi）[15]相同，用蒸餾水培養就可使其萌發，但萌發率較低，本試驗結果為3.39%。其原因可能是花粉自身含有的營養物質能夠滿足花粉萌發的需求[16]。本研究結果表明，蔗糖質量濃度以10 g/L為澳洲石斛花粉離體萌發的最適質量濃度，此結果低于雜種卡特蘭[14]、聚石斛[15]、白芨[17]、無距蝦脊蘭（Calanthe tsoongiana）[6]、大花蕙蘭[18]的最適萌發蔗糖質量濃度。

單因素試驗中，H3BO3質量濃度為20、30、40 mg/L 下培養的花粉萌發率與其他組存在明顯差異，分別為11.06%、13.31%、12.17%，且三者間無明顯差異;正交試驗的方差分析顯示H3BO3與其他2個組分對澳洲石斛花粉萌發的影響都是極顯著的（P<0.01），且在質量濃度為40 mg/L時的組合花粉萌發率最高。綜合單因素和正交試驗結果，澳洲石斛花粉萌發的H3BO3最適質量濃度為40 mg/L。雖然H3BO3在植物組織中含量很低[19]，但是H3BO3能與蔗糖形成絡合物，促進了糖的吸收、轉運與代謝，提高花粉的萌發率。此外，H3BO3還參與果膠的合成，促進花粉管壁的形成[20]，大大增加了花粉管生長的長度。

相關研究表明，花粉的離體萌發還需要從培養基中吸收大量鈣離子，降低培養基中的鈣離子質量濃度會明顯抑制花粉萌發，并且外源鈣可以替代花粉萌發時的群體效應[21]，因此，適宜的鈣離子質量濃度是花粉體外萌發所必需的[22]。本研究結果表明，CaCl2在單因素試驗中作用不是很明顯，在最適質量濃度 30 mg/L 時花粉萌發率為5.13%;但與蔗糖和H3BO3組合時，能起到交互作用，促進花粉萌發，在30 mg/L時萌發率最高。究其原因，花粉萌發時不需要外源Ca2+并不表明就不需要Ca2+的參與，很有可能是不同品種花粉自身釋放的Ca2+含量不一樣，花粉大多儲存在花粉壁中，當在液體培養液中培養時，花粉水合釋放自身Ca2+，有的品種花粉自身所含Ca2+就足以滿足生長發育所需，故而對外源Ca2+表現為非必需[23]。因此，澳洲石斛正交試驗時，30 mg/L CaCl2與蔗糖和H3BO3組合起促進作用的確切機制還有待進一步探討。

本研究綜合單因素試驗及正交試驗結果的方差分析和比較，得出澳洲石斛的最適培養基組合為10 g/L蔗糖+40 mg/L H3BO3+30 mg/L CaCl2。影響植物花粉萌發的因素有很多，不同的植物種類花粉萌發所需要的蔗糖、H3BO3、CaCl2的最適質量濃度都不完全一致[24]，且不同的培養條件下，花粉的萌發情況也各不相同，本試驗僅對同一培養條件下的不同培養液組分進行了研究，關于澳洲石斛的最適培養條件還待進一步探討，本試驗結果僅供后續的深入研究作參考。

參考文獻：

[1]劉明華，朱?瑾. 石斛蘭[J]. 中國花卉盆景，2005（2）：17.

[2]吳應祥. 中國蘭花[M]. 2版. 北京：中國林業出版社，1993：106-107.

[3]鄧茜玫. 石斛蘭雜交親和性研究[D]. 北京：中國林業科學研究院，2013：1-2.

[4]李枝林，王玉英，王卜瓊，等. 蘭花遠緣雜交育種技術研究[J]. 中國野生植物資源，2007，26（4）：52-56.

[5]王曉樂，楊艷萍，付雙彬，等. 浙江寒蘭花粉萌發及貯藏特性[J]. 浙江農業科學，2018，59（2）：241-243.

[6]錢?鑫，劉?芬，牛曉玲，等. 無距蝦脊蘭花粉離體萌發及儲藏條件的研究[J]. 西北植物學報，2014，34（2）：341-348.

[7]朱根發，王碧青，陳明莉，等. 大花蕙蘭與蘭屬植物種間雜交研究[J]. 植物學通報，2005，22（4）：445-448.

[8]朱根發. 紅花系大花蕙蘭的雜交親本及育種進展[J]. 中國花卉園藝，2003（8）：20-22.

[9]季彪俊. 田間試驗的SPSS統計分析[M]. 北京：中國農業出版社，2014：92-93.

[10]尚忠林. 細胞外鈣調素對花粉細胞內鈣離子的影響及其信號傳遞途徑的研究[D]. 北京：中國農業大學，2001：88-90.

[11]馬力耕，徐小冬，崔素娟，等. 細胞外鈣調素對花粉萌發和花粉管伸長的影響[J]. 科學通報，1997，42（24）：2648-2652.

[12]于金平，王媛媛，張?琪，等. 百合不同品種間花粉萌發活力檢測分析[J]. 沈陽農業大學學報，2018，49（1）：14-19.

[13]李鳳榮. 幾種杜鵑花粉萌發和花粉貯藏方法研究[C]//張啟翔. 中國觀賞園藝研究進展2013. 北京：中國林業出版社，2017：147-150.

[14]鄭寶強，王?雁，彭鎮華，等. 卡特蘭花粉萌發和花粉貯藏性研究[C]//中國園藝學會觀賞園藝專業委員會2011年學術年會論文集. 北京：中國林業出版社，2011：188-192.

[15]鄧茜玫，鄭寶強，郭?欣，等. 聚石斛花粉生活力及貯藏的研究[J]. 林業科學研究，2014，27（5）：657-661.

[16]劉自剛，呼天明，楊亞麗. 黃芩花粉離體萌發與花粉管生長研究[J]. 中國中藥雜志，2011，36（19）：2636-2640.

[17]黃春球，宋天順，李明靜，等. 白芨花粉活力測定與花粉保存[J]. 北方園藝，2011（3）：182-184.

[18]王利民，王四清，王彩霞，等. 大花蕙蘭花粉離體萌發試驗初報[J]. 中國農學通報，2005，21（4）：122-124，161.

[19]年玉欣，羅鳳霞，張?穎，等. 測定百合花粉生命力的液體培養基研究[J]. 園藝學報，2005，32（5）：922-925.

[20]志佐誠，加藤幸雄. 植物生殖生理學[M]. 東京：誠文堂新光社，1962：176-180.

[21]胡適宜. 被子植物胚胎學[M]. 北京：人民教育出版社，1982：103-136.

[22]Brewbaker J L，Kwack B H. The essential role of calciumion in pollen germination and pollen tube growth[J]. American Journal of Botany，1963，50（9）：859-865.

[23]賈文慶，劉?宇，陳?韻，等. Ca2+與蔥蘭花粉萌發和花粉管生長的關系[J]. 西北林學院學報，2007，22（4）：98-99，105.

[24]蘆?娟，蘇?瑾，姜成英，等. 不同濃度的糖、硼、鈣對油橄欖花粉萌發的影響[J]. 經濟林研究，2017，35（1）：103-107.