鴿源綠膿桿菌的分離鑒定及致病性試驗

李珮瑤 高晶萍 田勇 徐明舉 利凱 李軍 張瑞華 徐彤

摘要：從疑似賽鴿綠膿桿菌感染病料中分離綠膿桿菌并進行相關致病性試驗和藥敏試驗，為今后賽鴿綠膿桿菌防治提供參考。采用常規方法從肝臟、肺臟等組織中無菌釣取細菌于普通瓊脂、麥康凱、鮮血瓊脂平板培養基中，隨后進行染色鏡檢、生化試驗鑒定;對分離菌株進行致病性研究，將10只未經免疫的30～40日齡的雛鴿隨機分為對照組和試驗組進行感染，10只BALB/c小鼠同樣隨機分組進行感染，觀察并記錄感染動物臨床癥狀及死亡率;通過藥敏試驗檢測該菌對慶大霉素、恩諾沙星、復方新諾明等10余種藥的敏感性。結果表明，分離得到的菌株根據培養及菌落特征、生化試驗確定為綠膿桿菌;人工感染小鼠發病率為100%，死亡率為60%;試驗組鴿子發病率為60%，無死亡;該菌對慶大霉素、恩諾沙星、妥布霉素和環丙沙星高度敏感。

關鍵詞：賽鴿;綠膿桿菌;細菌分離鑒定;致病性;藥敏試驗

中圖分類號：S182?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0189-03

收稿日期：2019-03-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：31672522）;國家自然科學基金青年科學基金（編號：31602030）;河北省第二期現代農業產業技術體系蛋肉雞產業創新團隊建設專項經費（編號：HBCT2018150207）;河北省教育廳在讀研究生創新能力培養資助項目（編號：CXZZSS2018129）;賽鴿主要疫病防控技術體系研究（自籌經費）。

作者簡介：李珮瑤（1996—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事基礎獸醫學研究。E-mail：peiyaoli19@163.com。

通信作者：徐?彤，教授，主要從事動物流感病毒誘導肺損傷機理研究。E-mail：xutong1969@sohu.com。

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）1882年由Gessard從傷口膿液中首次分離報道[1]。該菌在自然界中分布十分廣泛，是臨床常見的條件致病菌之一。臨床中常因注射污染、疲勞運輸、驚嚇等應激因素導致動物機體抵抗力下降，引起該病發生。綠膿桿菌可引起多種家畜、家禽、野生動物發病，尤其可引起雛雞和貂的出血性肺炎、奶牛的子宮炎和乳房炎等，同時也可感染人類[2]。隨著集約化的快速發展和養殖規模的不斷擴大，該菌在感染過程中的角色也由之前的繼發或混合感染逐漸演變為原發或并發[3]，這使得該病死亡率愈來愈高。近年，雛雞、山羊、水貂、獺兔、狐貍、小熊貓及鴕鳥等均有感染綠膿桿菌的報道[4-10]，可見綠膿桿菌對不同種類的動物均有易感性，但臨床表現及剖檢癥狀有差異。

近年來，賽鴿成為一項重要的競技運動，隨著人們的關注度越來越高，賽鴿運動飛速發展。然而，在“集鴿”這一特殊飼養模式下，不同免疫水平的鴿子經長途運輸后集中于同一棚內，因此臨床中鴿綠膿桿菌一般是新城疫、鴿痘等疾病的繼發菌[11]，導致賽鴿大量死亡，給養殖戶帶來不可估量的經濟損失。但由于人們之前對其重視程度不夠，在臨床中沒有良好的治療方案。筆者通過對臨床病料進行實驗室細菌分離鑒定并做相關致病性試驗及藥敏試驗，為臨床中綠膿桿菌的預防和治療提供參考依據。

1?材料與方法

1.1?病料及試驗動物

疑似鴿綠膿桿菌的病料，由天津某賽鴿公棚提供;6～8周齡、SPF級BALB/c小鼠，購于北京實驗動物中心;30～40日齡、未經任何免疫試驗的雛鴿10羽，購于河北省張家口市某肉鴿養殖戶。

1.2?試劑

普通瓊脂培養基、麥康凱培養基、鮮血瓊脂培養基，購于北京奧博星生物技術有限責任公司;蘇木精、伊紅，購于天津光復精細化學研究所有限公司;藥敏片，購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3?主要儀器

電熱恒溫培養箱，購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠;超凈臺，購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;顯微鏡，購自Olympus。

1.4?背景調查

病鴿主要表現吃食減少，精神不振;不同程度下痢，糞便水樣，呈淡黃綠色，嚴重的糞中帶血;腹部膨大，手壓柔軟，后期呈腹式呼吸;有的眼周圍發生不同程度水腫，水腫部破裂流出液體，形成痂皮，眼全閉或半閉，流淚;頸部皮下水腫，嚴重的兩腿內側部皮下也見水腫。

1.5?細菌分離

從病死鴿的肝臟、脾臟、肺臟等無菌操作釣菌分別劃線接種于普通瓊脂、鮮血瓊脂和麥康凱培養基，置于恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，觀察培養基顏色及菌落形態，挑取有代表性的菌落進行純化培養。

1.6?細菌鑒定

1.6.1?涂片染色鏡檢

將純化培養的細菌典型菌落釣菌進行涂片，進行革蘭氏染色，于油鏡下觀察菌落的形態及染色特征。

1.6.2?生化鑒定

將純化后的細菌分別接種于葡萄糖、乳糖、苯丙氨酸、甲基紅、三糖鐵等生化管中，放置于37 ℃培養箱中，培養24 h，觀察并記錄生化結果。

1.7?致病性試驗

1.7.1?BALB/c小鼠致病性試驗

采用上述細菌接種鮮血瓊脂培養基培養18 h后，將10只SPF BALB/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組各5只，感染組每只腹腔注射0.1 mL該細菌，對照組相同途徑注射 0.1 mL 生理鹽水，飼養于環境相同的獨立通風籠內，觀察并記錄其臨床表現、發病率及死亡率。取死亡小鼠的肝臟進行釣菌、染色，以驗證致病菌與接種菌是否一致。

1.7.2?鴿子致病性試驗

取10羽未經免疫、30～40日齡的雛鴿，隨機分為感染組和對照組，每組5羽，感染組每羽肌肉注射0.2 mL細菌鮮血瓊脂培養物，對照組肌肉注射0.2 mL生理鹽水，觀察記錄其臨床癥狀、發病率和死亡率。

1.8?藥敏試驗

參照Kirby-Barer氏法，將純培養的綠膿桿菌鮮血瓊脂培養物均勻涂抹至普通瓊脂平板的表面，用鑷子無菌取抗生素藥敏試紙片均勻等距貼在培養基表面，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h后觀察并記錄不同藥物抑菌圈的直徑，判定該菌對不同藥物的敏感性。

2?結果與分析

2.1?細菌分離結果

在普通瓊脂培養基上18 h已長出濕潤、光滑的藍綠色菌落;在麥康凱培養基中生長良好，呈邊緣整齊、光滑的暗綠色菌落;鮮血瓊脂培養基中可見細菌生長良好，菌落周圍有溶血;可看到試管整體呈綠色，隨著培養時間的延長，培養基的表面有一層菌膜形成。

2.2?鑒定結果

2.2.1?細菌鑒定結果

經革蘭氏染色后，鏡下可見無芽孢、中等大小的紅色桿菌。

2.2.2?生化鑒定結果

由表1可知，該菌發酵葡萄糖，不分解乳糖，三糖鐵不產生硫化氫，試管底部未變黃，甲基紅（M.R.）試驗呈陰性，可分解尿素，能液化明膠，符合綠膿桿菌的生化特點。根據染色鏡檢特征和生化結果可確定該菌為綠膿桿菌。

2.3?致病性試驗

2.3.1?BALB/c小鼠致病性試驗

對照組精神狀態良好、行動十分敏捷、被毛光滑。試驗組接種細菌后7 h，小鼠全部出現精神沉郁、行動遲緩現象;22 h 死亡1只，其余4只精神萎靡;45 h死亡2只，剩余2只被毛粗亂無光澤;96 h剩余2只小鼠有恢復跡象。綜上所述，共死亡3只小鼠，通過從死亡小鼠的肝臟釣菌，確定致病菌與接種菌一致。

2.3.2?鴿子致病性試驗

對照組鴿子無異常，試驗組鴿子接種24 h后糞便變為墨綠色稀糞，精神無異常;48 h時試驗組3羽鴿子出現精神沉郁、羽毛松亂、行動遲緩、糞便為綠色水樣稀糞;觀察1周，無死亡。

2.4?藥敏試驗

由表2可知，該菌對恩諾沙星、妥布霉素、慶大霉素和環丙沙星高度敏感，對丁胺卡那、阿奇霉素、復方新諾明中度敏感;而對青霉素、磺胺嘧啶等耐藥性較強。

3?討論與結論

綠膿桿菌在自然界土壤、空氣、水中分布廣泛，同時在各種動物的腸道和皮膚中也有存在，是臨床常見的條件致病菌。綠膿桿菌在雞中常是霉形體、雞痘等的繼發菌，還可與大腸桿菌等細菌發生混合感染[12-13];在水貂中常與克雷伯氏菌混合感染引發水貂的出血性肺炎[14-15]。隨著現代養鴿業的飛速發展，綠膿桿菌在鴿群中也漸有報道，常與鴿痘、鴿新城疫等發生混合感染，導致鴿大量死亡[16-17]。

本研究從天津某賽鴿養殖場分離到1株細菌，通過培養基生長特性、染色鏡檢、生化鑒定確定其為綠膿桿菌。隨后進行該菌的致病性研究，通過給小鼠、鴿子接種感染綠膿桿菌后發現該菌對兩者的致病性不同，試驗組小鼠的發病率為100%，病死率達60%，在臨床癥狀上表現比鴿子更為明顯，并且在剖檢過程中發現死亡小鼠整體腹部呈綠色，腸道黏液增多，其余癥狀不明顯;在鴿子的致病性試驗中鴿子的發病率為60%，未發生死亡。

臨床中綠膿桿菌一般呈繼發感染，并且臨床癥狀缺乏明顯特征，由于在病程的不同階段表現出的臨床癥狀也不同，因此僅靠臨床癥狀不能判斷是否有綠膿桿菌感染，確診還須要借助實驗室細菌分離鑒定等手段。

在細菌性疾病的治療過程中，抗生素的耐藥性是經常需要面臨的問題。綠膿桿菌對多種抗生素均有耐藥性，并且不同菌株對同一抗生素的敏感性也不同。藥敏結果表明，此次分離的綠膿桿菌對恩諾沙星、妥布霉素、慶大霉素和環丙沙星均高度敏感。在后期治療的過程中，通過慶大霉素的治療，該公棚賽鴿的癥狀的確得到緩解。

臨床中一般在動物機體抵抗力下降時易被繼發感染綠膿桿菌，該菌本身的致病性不強，但它對多種藥物均有耐藥性，因此在臨床中預防本病應從改善養殖場飼養管理條件、加強獸醫衛生措施著手，嚴格按照規定要求做好種蛋收集、保存及孵化全過程以及孵化設備、環境、注射疫苗器具的清洗和消毒工作。在養殖場通過飲水或拌料口服大劑量的慶大霉素等高度敏感藥物，對該菌亦有一定的防治作用。

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