顆粒細胞Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達與PCOS患者脂代謝及胚胎質量的相關性

楊珖，姚桂東，孫瑩璞

(鄭州大學第一附屬醫院 生殖醫學中心，河南 鄭州 450052)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女最常見的生殖內分泌疾病之一，全世界的發病率達6%～26%[1]，常伴有生殖系統、代謝系統和心理的異常。PCOS的癥狀和體征可始于青春期，包括月經不調、雄激素過多、肥胖、胰島素抵抗和血清黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高等。由于多數PCOS患者無排卵或稀發排卵，因此，PCOS是影響女性卵巢功能并可導致不孕的重要因素。此外，研究表明，有PCOS的女性患者不僅發生2型糖尿病的風險增加[2]，還有多種心血管疾病相關的高危因素[3]。PCOS的病理生理學非常復雜，遺傳和環境因素目前被認為與疾病的發生密切有關，但確切的發病機制尚不清楚。考慮到PCOS的長期不利后果，及早診治顯得尤為重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200 nt且無蛋白質編碼功能的一類RNA分子。前研究發現，LncRNA可在多個水平調控基因的表達和蛋白功能的發揮，廣泛參與許多病理和生理過程：其可通過與轉錄因子結合調控下游靶基因的表達；可通過與調節蛋白結合形成核酸蛋白質復合體，影響下游蛋白的功能發揮等[4-5]。近年來，LncRNA已成為多個領域的研究熱點。

目前已發現多種LncRNA參與調控PCOS的病理生理變化[6-8]。Lnc-ADAMTS1-1∶1位于人21號染色體，是與卵巢功能密切相關的新型LncRNA[9]，其與PCOS的疾病相關性尚無報道。本研究通過探討Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS發生中的重要作用，為PCOS的診斷和治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 樣本收集本研究收集2018年8月至2019年1月在鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心接受體外受精(invitrofertilization，IVF)治療的不孕患者，共59例，其中PCOS患者35例。其診斷基于2003年鹿特丹標準，即滿足以下3個臨床特征中的2個或2個以上：月經失調(月經稀發或閉經)；有雄激素過多的臨床表現或高雄激素血癥；超聲檢測下可見多囊卵巢(雙側卵巢內2～9 mm的卵泡大于12個，或卵巢體積>10 cm3)。另有24例排卵周期正常的女性作為對照組(因男性不育或/和輸卵管因素不孕而接受輔助生殖技術治療)。對照組患者均無高雄激素血癥的臨床或生化特征，或與PCOS相關的其他內分泌疾病。此外，有系統性疾病、甲狀腺功能異常、子宮內膜異位癥、泌乳素水平異常或卵巢手術史的女性被排除在本研究外。

患者的臨床和實驗室數據來自本中心生殖管理系統。收集患者體質量指數(body mass index，BMI)、抗穆勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)和血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，評估健康狀況。月經來潮第2～3天測定患者基礎內分泌水平，包括孕酮(progesterone，P)、睪酮(testosterone，T)、泌乳素(prolactin，PRL)、雌二醇(estradio，E2)、卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)和黃體生成素(lutein hormone，LH)。周期促性腺激素(gonadotropin，Gn)總量為該周期促排卵治療時注射Gn的總量。

IVF實驗室指標：卵母細胞成熟率=MⅡ卵母細胞數/獲卵數，受精率=受精數/獲卵數，卵裂率=卵裂胚胎總數/受精數，優胚率=優質胚胎數/受精數，囊胚形成率=囊胚數/囊胚培養數。此外，由2位胚胎學家根據peter胚胎評分系統[10]評價胚胎質量。優質胚胎指Ⅰ級和Ⅱ級的胚胎。

本研究通過鄭州大學第一附屬醫院生物醫學倫理委員會批準(2018-KY-65)。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養根據先前研究中提取顆粒細胞的方法[11]，在患者行卵巢穿刺取卵術當天獲得卵泡液，并通過密度梯度離心法純化原代顆粒細胞。將純化的原代顆粒細胞凍于液氮中，待隨后提取細胞總RNA使用。

1.3 實時PCR使用TRIZOL法(Invitrogen，美國)裂解細胞并提取細胞內總RNA，使用Nanodrop(Thermofisher Science，美國)測量樣品的RNA濃度。根據濃度計算反轉錄系統中所需的RNA量，使用反轉錄試劑盒(Bio-Rad Laboratories，美國)將RNA反轉錄為cDNA。使用5×SYBR Green supermix(Bio-Rad Laboratories)在Bio-Rad 7500實時PCR系統上進行實時PCR反應。PCR檢測時所用Lnc-ADAMTS1-1∶1的引物序列為：CAGAGTGAGCAACATCGCAG，TCTTCCAGCGCAAAGTTGGA；GAPDH的引物序列為GACAGTCAGCCGCATCTTCT，GCGCCCAATACGACCAAATC。GAPDH為內參基因，通過2-△△Ct法計算靶基因相對于內參的相對表達倍數。

2 結果

2.1 臨床數據總結兩組患者的年齡、P、PRL、E2、TC、周期Gn使用總量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PCOS組患者BMI、AMH、LH、T、TG、LDL高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；PCOS組患者FSH和HDL水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 IVF實驗室數據總結對照組獲卵數為(15.17±1.25)個，PCOS組獲卵數為(16.20±1.00)個，差異無統計學意義(t=0.650，P>0.05)。兩組卵母細胞成熟率、受精率和卵裂率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；PCOS組患者優胚率和囊胚形成率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 兩組患者一般資料和臨床指標比較

注：BMI—體質量指數；AMH—抗穆勒激素；FSH—卵泡刺激素；LH—黃體生成素；E2—雌二醇；T—睪酮；P—孕酮；PRL—催乳素；Gn—促性腺激素，TG—甘油三酯；TC—總膽固醇；HDL—高密度脂蛋白；LDL—低密度脂蛋白。

表2 兩組患者IVF實驗室指標比較(%)

2.3 Lnc-ADAMTS1-1∶1在顆粒細胞中的表達PCOS組顆粒細胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的相對表達量(3.74±0.35)高于對照組(1.78±0.31)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：a代表P<0.001。

圖1Lnc-ADAMTS1-1∶1在兩組患者顆粒細胞中的表達

2.4 顆粒細胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達與患者臨床指標及IVF實驗室指標的相關性對照組Lnc-ADAMTS1-1∶1與BMI呈顯著正相關(r=0.543，P=0.006)；PCOS組Lnc-ADAMTS1-1∶1與血清PRL水平呈正相關(r=0.361，P=0.033)，與血清TC水平(r=-0.431，P=0.010)和LDL水平(r=-0.384，P=0.023)呈負相關。Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達與優胚率呈顯著正相關(r=0.413，P=0.026)。見表3、4。

表3 兩組患者顆粒細胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達與臨床指標的相關性

注：BMI—體質量指數；AMH—抗穆勒激素；FSH—卵泡刺激素；LH—黃體生成素；E2—雌二醇；T—睪酮；P—孕酮；PRL—催乳素；Gn—促性腺激素，TG—甘油三酯；TC—總膽固醇；HDL—高密度脂蛋白；LDL—低密度脂蛋白。

表4 兩組患者顆粒細胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達與IVF實驗室指標的相關性

2.5 Lnc-ADAMTS1-1∶1對PCOS的診斷意義曲線下面積為0.851(95%置信區間：0.744～0.958)，且Lnc-ADAMTS1-1∶1/GAPDH的截斷值為1.909時靈敏度為0.881，特異性為0.760。見圖2。

圖2 顆粒細胞中Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達水平診斷PCOS的ROC曲線

3 討論

近年來，LncRNA參與PCOS的內分泌和卵巢功能的調控成為了研究的熱點。雄激素反應性CTBP1-AS在PCOS患者中表達升高[12]，可能通過調節雄激素受體的活性，進而影響PCOS患者高雄激素的臨床表型[13]；BANCR可能通過影響Bax和p53的表達促進PCOS患者顆粒細胞的凋亡[7]；小鼠中沉默SRA可明顯緩解PCOS的表型，且可抑制脫氫表雄酮暴露下卵巢顆粒細胞中腫瘤壞死因子-α的產生和核轉錄因子-κB的激活[6]。有關LncRNA參與女性生殖功能的調控研究仍處于早期階段，目前仍需要深入地進行。Lnc-ADAMTS1-1∶1是一種新型LncRNA[9]，其與卵巢疾病相關的研究尚無幾例。本研究發現Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS患者顆粒細胞中顯著高表達，且與患者脂代謝水平以及IVF胚胎質量有顯著相關性。

研究表明，PCOS患者的血清TG、TC、LDL水平高于對照組，HDL水平明顯降低[14]，且由于脂代謝異常，并發2型糖尿病與心血管疾病的風險居高[2-3]。本研究結果也提示PCOS患者存在明顯的血脂代謝異常。本研究顯示，PCOS患者Lnc-ADAMTS1-1∶1的表達水平與TC和LDL呈顯著負相關，與HDL呈正相關。因此，推測Lnc-ADAMTS1-1∶1可能作為一種保護因子對PCOS患者血脂代謝的異常起抑制作用，這可能成為改善PCOS血脂異常的新策略。

本研究顯示，Lnc-ADAMTS1-1∶1與PCOS患者IVF優胚率呈顯著正相關。根據之前的研究，Lnc-ADAMTS1-1∶1在卵巢早衰患者的卵巢中顯著差異表達，提示其與卵巢功能密切相關[9]。Yao等[9]研究還表明，Lnc-ADAMTS1-1∶1在ADAMTS1基因的5’端，在卵巢組織中與ADAMTS1的表達呈顯著正相關，且生物信息學分析結果提示，ADAMTS1是Lnc-ADAMTS1-1∶1的潛在靶基因。ADAMTS1屬于ADAMTS家族成員，是一種新型金屬蛋白酶[15]。在卵巢中，ADAMTS1可促進卵母細胞的成熟，并在排卵時裂解多功能蛋白聚糖等細胞外基質，影響卵丘卵母細胞復合體的擴張，確保排卵的順利發生[16-17]。而ADAMTS1與PCOS的發生發展也密切相關，在PCOS患者來源的卵巢、顆粒細胞、卵泡液樣本中均顯著性差異表達，且對PCOS患者IVF結局有著很好的預測作用[18-20]。研究表明，行IVF治療的PCOS患者由于卵泡發育微環境的異常而面臨卵子和胚胎質量的下降，導致助孕結局的失敗[21]。基于此，Lnc-ADAMTS1-1∶1可否通過調控ADAMTS1改善PCOS患者IVF卵子質量和胚胎發育結局等科學問題值得深入研究。

本研究明確了Lnc-ADAMTS1-1∶1在PCOS患者顆粒細胞中的表達趨勢，同時發現其對PCOS患者脂代謝和IVF胚胎質量的顯著相關性，這為更進一步地了解LncRNA在PCOS發病進程中的作用以及更深入地理解PCOS患者代謝狀態和卵泡發育微環境提供了新的線索。但本次實驗例數較少，在未來的研究中可增多樣本量和樣本種類，使之有望成為預測PCOS患者脂代謝狀態及IVF-ET助孕結局的新指標。