豐富環(huán)境對缺血性腦卒中小鼠海馬區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)和認(rèn)知功能的效果

王傳杰，吳毅，陶峰，楊雷

1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院康復(fù)科，上海市 201508；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院康復(fù)科，上海市200040

腦卒中是全球致殘和死亡的第二大原因[1]，臨床治療手段較少，臨床應(yīng)用有很大局限性[2-6]，大部分患者遺留各種后遺癥，其中相當(dāng)部分有認(rèn)知功能障礙[7]。

豐富環(huán)境被證明可以改善人類的認(rèn)知功能損傷[8]，但作用機制尚不清楚。細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜過程，Bcl-2 家族在其調(diào)控中起重要作用，其中Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡，Bax 則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax 復(fù)合體可以調(diào)控細(xì)胞死亡過程[9]。本研究復(fù)制小鼠永久性左側(cè)大腦中動脈閉塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)，觀察豐富環(huán)境干預(yù)對小鼠認(rèn)知功能，以及海馬區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性C57BL/6小鼠50只〔上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2018-0004〕，其中42只接受pMCAO手術(shù)，8只為假手術(shù)組。

1.2 造模與分組

參照相關(guān)文獻(xiàn)構(gòu)建小鼠pMCAO 模型[11]。術(shù)后經(jīng)評定，32只造模成功。將造模成功的小鼠按隨機數(shù)字表法分為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組(n=16)和豐富環(huán)境組(n=16)。假手術(shù)組小鼠僅分離左側(cè)頸總動脈，不插入線栓。

所有操作符合復(fù)旦大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會的實驗操作規(guī)范。

1.3 豐富環(huán)境與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境的構(gòu)建

術(shù)后3 d，假手術(shù)組和標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組全天置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境籠中飼養(yǎng)，豐富環(huán)境組全天置于豐富環(huán)境籠中飼養(yǎng)，共21 d。

參照以往文獻(xiàn)設(shè)置豐富環(huán)境鼠籠[10]：65×75×25 cm，含攀登梯、塑料管道、轉(zhuǎn)輪、小盒子等，每籠飼養(yǎng)8～10 只小鼠，籠內(nèi)物品每3 天更換一次。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(standard environment，SE)鼠籠：21×27×16 cm，僅放置鼠糧、水、墊料。均提供12 h 晝夜光變化，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫(23±2)℃，濕度56%。

1.4 Morris水迷宮實驗

干預(yù)后，各組取8只小鼠行Morris水迷宮實驗[12]。所有實驗均在安靜環(huán)境中進(jìn)行。水迷宮為直徑150 cm的圓形水池，分成4 個象限(STOELTING 公司)。水溫20～22 ℃。10 cm2隱蔽圓形平臺位于東北象限，沒入水下0.5～1.0 cm。

包括兩個評估：空間學(xué)習(xí)能力實驗和空間記憶能力實驗。空間學(xué)習(xí)能力實驗連續(xù)進(jìn)行5 d，每天4 次，分別從東南、南，西北、西4 個方向入水。如果小鼠在60 s 內(nèi)未到達(dá)平臺，則將其引導(dǎo)到平臺。小鼠到達(dá)平臺后，在平臺停留15 s。記錄各組逃避潛伏期。第6 天行空間記憶能力實驗。從游泳池中取出平臺，讓小鼠自由游泳60 s，系統(tǒng)自動記錄小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)游動的時間和距離，以及小鼠穿過原平臺區(qū)域的次數(shù)。

1.5 Western blotting[13]

干預(yù)后，另8 只小鼠斷頭取腦，取左側(cè)完整海馬組織。提取海馬區(qū)蛋白。蛋白裂解液裂解，4 ℃、14000 r/min 離心30 min，取上清。BCA 試劑盒(PIERCE 公司)檢測蛋白濃度，95～100 ℃10 min。取蛋白樣品20 μl，10%SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 公司)。室溫封閉液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中封閉1 h，加入Bcl-2 (1∶1000，ABCAM 公司)、Bax (1∶1000，ABCAM 公 司)和β-tubulin (1∶1000，SANTA CRUZ公司)一抗，4 ℃隔夜孵育。TBST洗滌3次，室溫加入IgG 二抗(1∶5000)孵育60 min。Image J測定各條帶相對光密度。

1.6 免疫熒光染色[14]

取小鼠大腦切片，室溫下4%多聚甲醛固定10 min，10% BSA 封閉60 min。分別加入Bcl-2 (1∶200，ABCAM 公 司)和Bax (1∶200，ABCAM 公 司)一 抗，4 ℃濕盒過夜。PBS 沖洗3 次，加熒光偶聯(lián)IgG 二抗(1：2000，ABCAM 公司)室溫孵育60 min。共焦顯微鏡(LEICA 公司)觀察。每個標(biāo)本取4 張切片，海馬CA3 區(qū)攝片(×400)，Image Pro Plus 6.0 軟件計算積分光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料服從正態(tài)分布，以()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

豐富環(huán)境組較標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)。見表1。第6 天記憶能力測試發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境組在目標(biāo)象限中游動的距離和時間以及穿過原平臺的次數(shù)也較標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組多(P＜0.05)。見表2。

2.2 Western blotting和免疫熒光染色

豐富環(huán)境組Bcl-2、Bax 和Bcl-2/Bax 均較標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)組升高(P＜0.05)。見圖1、圖2，表3、表4。

3 討論

腦卒中主要包括出血性和缺血性兩種，缺血性腦卒中約占70%[15]。腦卒中存活者中約55.9%并發(fā)認(rèn)知功能障礙，其中大部分為腦缺血患者[16]。本研究顯示，豐富環(huán)境干預(yù)可明顯改善腦卒中小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，可能與調(diào)控小鼠缺血后海馬凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。

表1 各組Morris水迷宮逃避潛伏期比較(s)

表2 各組Morris水迷宮目標(biāo)象限中游動距離和時間以及穿過原平臺次數(shù)比較

表3 各組Western blotting蛋白表達(dá)比較(/β-tubulin)

表4 各組Bcl-2、Bax免疫熒光積分光密度

圖1 各組Western blotting結(jié)果

以往研究發(fā)現(xiàn)[17-19]，豐富環(huán)境改善小鼠腦卒中后學(xué)習(xí)及記憶功能障礙的機制可能與促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。豐富環(huán)境可以改善腦缺血小鼠海馬區(qū)突觸可塑性[20-21]。豐富環(huán)境神經(jīng)保護(hù)的潛在機制主要有神經(jīng)發(fā)生[22]、突觸再生[23-24]或血管再生[25]。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦缺血后神經(jīng)元死亡的主要原因之一[26]，Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[27-29]。被動運動和缺血前主動運動均能通過上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)和維持Bcl-2/Bax 的比率，抑制梗死周圍區(qū)域細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元丟失[30-33]。豐富環(huán)境可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善腦卒中后大鼠運動功能[34]。腦梗死同側(cè)海馬CA1區(qū)可發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，可能由于促凋亡信號通過從梗死區(qū)到遠(yuǎn)側(cè)海馬的星形膠質(zhì)細(xì)胞間隙連接傳播所致[35]。本研究顯示，減少梗死側(cè)海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡，可能是豐富環(huán)境改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙的潛在機制之一。

大多數(shù)腦卒中患者的功能康復(fù)是一個長期過程，住院康復(fù)訓(xùn)練只占其中小部分時間，大部分康復(fù)在社區(qū)或家庭完成；為患者提供豐富環(huán)境，將對認(rèn)知功能恢復(fù)起重要作用。

豐富環(huán)境在腦卒中功能恢復(fù)中的作用機制非常復(fù)雜，調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)只是其中之一，且本研究只關(guān)注了兩個凋亡相關(guān)蛋白。今后將對凋亡蛋白通路上其他蛋白的調(diào)控進(jìn)行深入探索。

圖2 各組海馬CA3區(qū)Bcl-2和Bax表達(dá)(免疫熒光染色，×400)