電針對(duì)APP/PS1小鼠腦功能活動(dòng)影響的功能性磁共振成像研究

李樂(lè) ，黃盛，李瓏，張嘉泳，金婷婷，張宇豪，張冰雪，楊敏光，梁勝祥，王志福，柳維林，陶靜，陳立典

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市 350122；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州市 350122；3.福建康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)，福建福州市 350122；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建福州市350122

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種發(fā)病隱匿、多發(fā)生在60歲以上人群的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上較為典型的癥狀是記憶功能下降等認(rèn)知功能障礙[1]。AD的主要病理特點(diǎn)是皮質(zhì)和海馬中β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)斑塊沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)出現(xiàn)[2]。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因型被廣泛應(yīng)用于AD 基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。

研究顯示[3]，AD中神經(jīng)元活動(dòng)失調(diào)先于神經(jīng)元損傷，并可能促進(jìn)易損腦區(qū)神經(jīng)元退化。AD 患者靜息狀態(tài)下，海馬、后扣帶和側(cè)頂葉皮質(zhì)等腦區(qū)功能活動(dòng)下降[4]；當(dāng)患者確診為AD 時(shí)，Aβ 沉積進(jìn)一步蔓延至額葉、頂葉等腦區(qū)。提示海馬等學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)在AD 早期就發(fā)生功能異常，隨著受侵腦區(qū)增多，病情不斷加重[5]。

目前臨床上缺少對(duì)AD 確切有效的治療方法[6]。針刺在臨床上廣泛使用，對(duì)認(rèn)知功能障礙有良好治療效果[7]。電針在針刺特定穴位的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入微量電刺激，以改善局部血液循環(huán)，調(diào)整人體功能。電針能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性，減輕氧化應(yīng)激，減緩海馬神經(jīng)元凋亡，從而減緩認(rèn)知功能障礙[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，電針APP/PSl 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，可以改善其學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的葡萄糖代謝和海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)，從而減緩小鼠學(xué)習(xí)記憶能力退化趨勢(shì)。本研究進(jìn)一步運(yùn)用小動(dòng)物磁共振成像觀察電針百會(huì)、神庭對(duì)APP/PS1小鼠腦功能活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因雄鼠和野生型雌鼠，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(閔)2014-001。培育后取后代雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為22 ℃，濕度50%～70%，光照12 h 黑夜12 h交替，自由攝食、飲水。

所有操作符合動(dòng)物保護(hù)與使用實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。

1.2 基因型鑒定和分組

小鼠出生21 d 后，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)進(jìn)行基因鑒定，取APP 和PS1 基因均為陽(yáng)性的小鼠16 只，飼養(yǎng)至4 月齡(體質(zhì)量20～25 g)，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和電針組，各8 只；同窩APP和PS1基因均陰性的雄性小鼠8只作為對(duì)照組。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和器材

異氟烷、小動(dòng)物呼吸麻醉劑：深圳瑞沃德生命科技有限公司。小鼠組織基因組DNA 提取試劑盒：BIOSPIN 公司。APP、PS1上下游引物，GADPH 上下游引物，100 bp marker：上海生工生物有限公司。PCR mastermix：FERMENTAS 公司。7.0 T 小動(dòng)物磁共 振 儀(MiniMR-60 MRI System 7.0 T)：BRUKER 公司。小鼠曠場(chǎng)測(cè)試箱：上海欣軟信息科技有限公司。華佗牌G6805 型電針治療儀和針灸針(直徑0.25 mm、長(zhǎng)25 mm)：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽和轉(zhuǎn)印槽：BIO-RAD公司。

1.4 干預(yù)方法

電針組固定，按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》確定小鼠百會(huì)、神庭位置[10]。針灸針直刺，接電針儀，正極接神庭、負(fù)極接百會(huì)，疏密波，頻率1/20 Hz，電壓2 V，每次30 min，隔日1 次，每周3 次，共16 周。模型組和對(duì)照組僅給予同樣程度抓取，并固定30 min。

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

訓(xùn)練和測(cè)試前24 h，將小鼠放入曠場(chǎng)測(cè)試箱中適應(yīng)環(huán)境。訓(xùn)練階段將兩個(gè)相同的待熟悉物體(A 和B)放在曠場(chǎng)測(cè)試箱的左后角和右后角，打開(kāi)視頻錄制設(shè)備，將小鼠面對(duì)箱前壁放置在前壁中點(diǎn)，自由探索10 min，將小鼠放回原飼養(yǎng)籠中，1 h后進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試階段將測(cè)試箱左后角的A物體取出，換成新物體C。放置小鼠步驟同上，自由探索5 min。計(jì)算新物體識(shí)別辨別指數(shù)(discrimination ratio，DR)。

TB：與物體B 接觸的時(shí)間；TC：與物體C 接觸的時(shí)間。

1.6 功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)

T2WI RARE 序列：TR/TE 4200/35 ms，視野20×20 mm，平均4，矩陣256×256，層數(shù)35，層厚0.5 mm。復(fù)制T2WI 參數(shù)中的掃描層數(shù)和圖框，b0勻場(chǎng)，后應(yīng)用血氧水平依賴(lài)功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging，BOLD-fMRI)。BOLD-fMRI 掃 描 參 數(shù)：TR/TE 2000/10279 ms，重復(fù)次數(shù)200，視野20×20 mm，平均4，矩陣64×64，層數(shù)30，層厚0.5 mm。

1.7 圖像分析

將BOLD-fMRI 圖像應(yīng)用插值法校正到同一時(shí)間界值。根據(jù)小鼠在掃描過(guò)程中頭動(dòng)情況，篩查數(shù)據(jù)，剔除平移＞1.5 mm 或旋轉(zhuǎn)＞1.5°的樣本。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有小鼠因頭動(dòng)而剔除。將圖像標(biāo)準(zhǔn)化到腦空間模板。采用線性回歸法剔除與神經(jīng)活動(dòng)無(wú)關(guān)的混雜信號(hào)，0.01～0.08 Hz 低頻濾波。計(jì)算特定體素與其最相鄰26個(gè)體素的時(shí)間序列，利用肯德?tīng)柡椭C系數(shù)計(jì)算一個(gè)團(tuán)塊(27 個(gè)體素)內(nèi)時(shí)間序列的一致性，得到局部一致性(regional homogeneity，ReHo)圖。采用2×2×2 mm高斯核對(duì)生成的ReHo圖進(jìn)行平滑。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定

待測(cè)樣本APP(350 bp)和PS1(608 bp)基因均強(qiáng)表達(dá)(圖1)，對(duì)應(yīng)小鼠為APP/PS1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠。

2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

干預(yù)前，各組DR 無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。干預(yù)后，與對(duì)照組相比，模型組DR 下降(P＜0.05)；與模型組相比，電針組DR升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組DR比較(%)

2.3 ReHo圖

干預(yù)前，與對(duì)照組相比，模型組右側(cè)基底前腦和左側(cè)海馬ReHo 降低(圖2)。干預(yù)后，與對(duì)照組相比，模型組ReHo 在雙側(cè)海馬區(qū)均下降(圖3)；與模型組相比，電針組雙側(cè)海馬區(qū)和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)ReHo 升高，前扣帶回ReHo下降(圖4)。

圖1 APP/PS1基因鑒定結(jié)果(部分小鼠)

圖2 干預(yù)前模型組與對(duì)照組間ReHo比較

圖3 干預(yù)后模型組與對(duì)照組間ReHo比較

圖4 干預(yù)后電針組與模型組間ReHo比較

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)[11]，電針百會(huì)60 d 后，AD 患者簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(Mini-Mental State Examination，MMSE)評(píng)分提高。本課題組前期Meta 分析顯示[12]，針刺百會(huì)、神庭穴4 周后，認(rèn)知障礙患者M(jìn)MSE 評(píng)分、神經(jīng)行為認(rèn)知狀況測(cè)試評(píng)分均有改善，事件相關(guān)電位P300 潛伏期縮短，P300 振幅增加。谷巍等[13]針刺AD 患者百會(huì)、神庭等穴4 個(gè)月，患者阿爾茨海默病評(píng)價(jià)量表-認(rèn)知分量表評(píng)分、MMSE 評(píng)分、數(shù)字廣度測(cè)試和日常生活活動(dòng)能力量表評(píng)分的改善均優(yōu)于藥物治療組，且安全性更高?；A(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)[14]，電針百會(huì)、神庭可延緩AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。

APP/PS1 小鼠的認(rèn)知障礙最早在4 月齡出現(xiàn)輕微改變，表現(xiàn)為Y-迷宮測(cè)試交替次數(shù)減少[15]。水迷宮測(cè)試中，3 月齡APP/PS1 小鼠與相同月齡野生型小鼠表現(xiàn)無(wú)明顯差異，5 月齡時(shí)潛伏期顯著延長(zhǎng)，9 月齡和12 月齡時(shí)呈持續(xù)性低水平空間記憶習(xí)得能力障礙[16]。另一研究發(fā)現(xiàn)[17]，APP/PS1 小鼠7 月齡時(shí)，Morris 水迷宮測(cè)試也出現(xiàn)記憶障礙。本研究選擇在4 月齡時(shí)進(jìn)行電針干預(yù)，以延緩APP/PS1 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降。

空間記憶的形成與海馬內(nèi)磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，pCREB)增加有關(guān)[18]。而pCREB 與 神經(jīng)元損傷后BOLD 信號(hào)有關(guān)，表現(xiàn)出腦區(qū)活動(dòng)水平下降和功能連接異常[19]。多模態(tài)神經(jīng)功能影像學(xué)顯示，內(nèi)側(cè)顳葉、基底神經(jīng)節(jié)、海馬、后側(cè)扣帶回等腦區(qū)在AD 進(jìn)展中進(jìn)行性功能降低，與認(rèn)知功能評(píng)分顯著相關(guān)[20]。

本研究顯示，4月齡APP/PS1小鼠ReHo下降區(qū)域首先發(fā)生在基底前腦和右側(cè)海馬?；浊澳X神經(jīng)元退化導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)分泌異常[21]?；浊澳X神經(jīng)元還表達(dá)P75 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體，基底前腦功能活動(dòng)異常對(duì)認(rèn)知功能障礙具有一定作用[22]。

作為學(xué)習(xí)記憶的核心腦區(qū)，海馬損傷會(huì)導(dǎo)致不同程度逆行性遺忘。嚙齒類(lèi)動(dòng)物海馬損傷后，表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙，且海馬損傷程度與行為學(xué)損傷高度一致[23]。一項(xiàng)基于AD 患者的長(zhǎng)期縱向觀察顯示[24]，CA1 神經(jīng)元在輕度AD 患者中減少，嚴(yán)重癡呆時(shí)減少更多。本研究顯示，8 月齡APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降，海馬ReHo 降低，壓后皮質(zhì)等腦區(qū)ReHo升高。壓后皮質(zhì)普遍認(rèn)為與記憶的提取相關(guān)，在從事記憶相關(guān)任務(wù)如回憶過(guò)往經(jīng)歷時(shí)，壓后皮質(zhì)被顯著激活[25]。基底前腦、海馬可能在AD 病理進(jìn)程中首先受累，而學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)，如壓后皮質(zhì)，Re-Ho 補(bǔ)償性升高；早期電針干預(yù)后，APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善，海馬ReHo升高。

綜上所述，電針百會(huì)、神庭可延緩APP/PS1 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退，可能與增強(qiáng)海馬的功能活動(dòng)有關(guān)。有待進(jìn)一步研究明確。