EGFR、P53、Ki-67在結直腸癌中表達及臨床病理學意義

焦俊霞 葉曉霞

(馬鞍山市中心醫院病理科，安徽 馬鞍山 243000)

結直腸癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率位居惡性腫瘤第4位，死亡率居第5位〔1〕。結直腸癌的發生、發展與腸上皮細胞的凋亡、增殖速度密切相關，多種基因、信號蛋白參與了這個過程；其中，表皮生長因子受體(EGFR)、P53基因主要通過調控細胞周期，進而調節細胞的增殖與分化，對腫瘤的發生、進展起重要作用。Ki-67是與細胞增殖密切相關的核抗原，是評估人體各種組織、細胞增殖簡單可靠的指標。EGFR、P53、Ki-67均參與了腫瘤細胞的增殖與分化。本研究采用免疫組化法檢測結直腸癌組織中EGFR、P53及Ki-67蛋白的表達，并進一步分析其與臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年1月至2018年1月馬鞍山市中心醫院病理科存檔的87例結直腸癌手術標本，所有病例手術前未行臨床治療(如放療、化療)。同時選取同病例癌旁正常腸黏膜87例作為對照。根據國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合會(UICC/AJCC)第8版消化道腫瘤TNM分期系統進行臨床病理分期。

1.2試劑與方法 所送檢手術標本常規采用4%甲醛溶液充分固定，石蠟包埋后4 μm厚連續切片，并進行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化標記。采用S-P免疫組化法，每例分別檢測EGFR (克隆號SP9)、P53(克隆號SP5)、Ki-67(克隆號MIB-1)蛋白的表達，并設立陰性對照。本研究所用抗體及免疫組織化學試劑盒均購于福州邁新生物技術開發公司。

1.3結果判斷 EGFR陽性表達定位于細胞膜。其陽性程度判斷根據陽性細胞數比例分4級：無陽性細胞(-)，<25%(+)、25%～50%()，≥50%()，細胞的染色深淺不作為判斷陽性程度的指標。P53和Ki-67陽性表達定位于細胞核。P53陽性程度判讀根據染色強度和陽性細胞數評分：1分為淡棕色，2分為棕黃色，3分為棕褐色; 陽性細胞數≤25%為1分，26%～50% 為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分; 染色程度評分與陽性細胞數評分相加：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，6～7分為強陽性()。Ki-67陽性細胞分3個等級：Ⅰ級為陽性細胞數<10%(-)，Ⅱ級為10%～50%(+)，Ⅲ級為>50%() 。評分過程由2名病理科醫生獨立完成。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗或Fisher的精確檢驗法、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1EGFR、P53和Ki-67在結直腸癌和癌旁組織中的表達 EGFR、P53蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率分別為35.6%(31/87)、65.5%(57/87)，而癌旁正常腸黏膜組織幾乎不表達〔2.3%(2/87)、4.6%(4/87)〕，差異有統計學意義(χ2=31.449、70.908，均P=0.000)。Ki-67蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率為95.4%(83/87)，而癌旁正常腸黏膜組織內Ki-67蛋白僅在腺體頸部有少量細胞核染色，陽性表達率為4.6%(4/87)，差異有統計學意義(χ2=158.703,P=0.000)。EGFR、P53和Ki-67蛋白在結直腸癌組織同時陽性表達26例(29.9%)。見圖1，圖2。

圖1 EGFR、Ki-67、P53在癌旁正常黏膜組織中的表達(免疫組化，×200)

圖2 EGFR、Ki-67、P53在結直腸癌中的表達(免疫組化，×400)

2.2EGFR、P53和Ki-67蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 EGFR、 P53和Ki-67蛋白陽性表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結有無轉移有顯著相關性，即隨腫瘤進展其陽性表達率增高(P<0.05)；與患者年齡、性別、大體類型無相關性(P>0.05)。見表1。

2.3EGFR、P53和Ki-67表達的相關性 在結直腸癌組織中EGFR與P53蛋白表達呈正相關，即隨腫瘤進展其陽性表達率增高(r=0.287,P=0.007)；Ki-67與EGFR、P53表達無相關性(r=0.163、0.049，P=0.131、0.654)。

表1 EGFR、 P53 和 Ki-67 蛋白陽性表達與臨床病理特征的關系(n)

3 討 論

EGFR為酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體，當其與配體結合后可活化下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路從而啟動信號轉導，進而誘導腫瘤細胞增殖、分化和侵襲〔2〕，其過度表達常提示腫瘤患者可能預后差、轉移早、生存期短〔3〕，可作為判斷結直腸癌進展、預后和轉歸的指標。本研究結果顯示，結直腸癌組織中EGFR表達水平與腫瘤的分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況顯著相關，與邵好青等〔4〕報道基本一致。近年來關于結直腸癌的治療，EGFR作為一個重要藥物靶點，有兩類EGFR拮抗劑獲準應用于臨床，分別為抗EGFR單克隆抗體(如西妥昔單抗、帕尼單抗)和小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(如埃羅替尼和吉非替尼)。

P53基因是調控人體細胞增殖與凋亡的重要基因，有野生型和突變型兩種分型。野生型P53基因存在于人體正常細胞中，是一個非常重要的抑癌基因。其作用機制為與細胞周期蛋白結合形成復合體，抑制細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)活性，使細胞停滯在G1期或引起細胞程序性死亡〔5〕。野生型P53半衰期短，免疫組織化學難以檢測。當機體細胞受到物理、化學因素刺激或自身機體的改變后，野生型P53基因發生自身空間結構改變，轉變為癌基因(即突變型P53)，失去了抑制CDK活性的功能，失去了調控機體細胞增殖、凋亡和DNA修復的作用，進而失去了抑制腫瘤形成的生物學特性，且進一步促進了機體細胞增殖及惡性轉化〔6〕，因此，可將突變型P53作為判斷結直腸癌浸潤、轉移能力的指標之一。由于突變型P53蛋白具有不易水解、半衰期長的特性，目前S-P免疫組化法檢測到的均為突變型P53。本研究結果示，P53蛋白表達水平與結直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移顯著相關，而癌旁正常黏膜幾乎未見P53的陽性表達，與溫玉婷等〔7〕報道結果基本相符。P53基因可能成為結直腸癌治療的另一個重要藥物靶點。有學者提出以下理論策略，干預P53與MDM2的相互作用、降解突變型P53蛋白、抑制突變P53下游信號轉導通路、RNA干擾突變P53表達、恢復突變P53構象等〔8〕。目前還沒有相應靶向藥物應用于臨床。

Ki-67是由MKI-67基因編碼的核蛋白，是一種核基質，為DNA復制提供場所，并參與染色體支架的組成，具有非組蛋白的特點，其功能與細胞有絲分裂密切相關〔9〕，在G1后期出現，在S、 G2期逐漸上升，至M期達到高峰，細胞有絲分裂后迅速減少，在G0期不表達，是表示細胞增殖程度的一項可靠指標。目前，有關Ki-67表達水平與結直腸癌的生物學行為之間的關系尚未達成共識。趙巖等〔10〕研究顯示，Ki-67蛋白的表達與結直腸癌TNM分期及淋巴結轉移有顯著相關性。而李偉等〔11〕研究顯示，Ki-67蛋白在直腸癌中的過表達與腫瘤Dukes分期、組織學分化程度等臨床病理參數無明顯相關性。本研究結果顯示，Ki-67在腫瘤細胞中高表達，隨腫瘤細胞分化程度降低、TNM分期增高及淋巴結轉移，Ki-67的表達指數明顯增高。Ki-67表達水平能反映腫瘤細胞的增殖狀態，可作為判斷結直腸癌生物學行為的一項指標。關于Ki-67蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數、轉移、復發及預后關系的不同報道，可能是由于樣本數量、實驗評判標準或地域差異性有關，還需要進一步擴大樣本量深入探討。

關于P53、EGFR和Ki-67在結直腸癌中的表達，我國已有單項或兩項小樣本研究，尚缺乏關于三者同時表達的研究報道。本組研究結果提示三者均參與了腫瘤細胞的無限增殖，隨腫瘤進展其陽性表達率增高，三者之間可能存在一定關聯。EGFR/PI3K/Akt信號通路可以通過激活CDK4來抑制P21Cipl和P27 Kip2(P21和P27為CDK抑制蛋白)的表達，使其在胞質中堆積而無法與CDK連接，進而促進細胞由G1期向S期進展，促進細胞的增殖和分化及腫瘤的發生、發展〔12〕；突變型P53蛋白失去抑制CDK活性，使細胞腫瘤細胞無限增殖〔6〕。由此推測，EGFR、P53均可通過調節CDK的活性，進一步調控腫瘤細胞的增殖與分化。本研究結果顯示，在結直腸癌組織中EGFR與P53表達呈正相關。Ki-67核抗原的表達隨細胞增殖周期的變化而變化，半衰期短，不易受生長因子誘導，直接反映腫瘤細胞的增殖活性。本研究結果顯示，在結直腸癌組織中Ki-67與EGFR、P53的表達無相關性。近年來，有關惡性腫瘤的精準醫療及個性化治療的提出，單靶點分子靶向藥物廣泛應用于臨床治療，如抗EGFR拮抗劑(如西妥昔單抗、貝伐珠單抗等)的應用，晚期結直腸癌患者的生存期得到了顯著改善，但也存在一些弊端，在RAS基因突變后抗EGFR類藥物的療效不佳〔13〕。由于在腫瘤發生及發展過程中，有許多基因參與，信號通路之間相互關聯，因此多個基因的聯合檢測將成為下一步的研究重點。本研究聯合檢測P53、EGFR和Ki-67有利于對結直腸癌進展、預后、新輔助及輔助化療的效果進行評估，并為結直腸癌的個性化治療及分子靶向治療提供科學依據。