硫酸軟骨素及白藜蘆醇對衰老模型小鼠腸道生態和大腦認知功能的影響

張夢樂 陳冬梅 李荷 曾慶平

(1廣東藥科大學，廣東 廣州 510006；2廣州中醫藥大學)

隨著人們生活方式的改變和人口老齡化的加劇，以大腦認知功能障礙為主要特征的慢性疾病如阿爾茨海默病(AD)等的發病率在全球范圍內逐年攀升〔1〕。微生物-腸-腦軸是將大腦與腸道功能整合的雙向信息交流系統，并涉及神經通路、免疫和內分泌機制，腸道微生物在該雙向信息交流系統中的參與十分活躍且具有一定影響〔2，3〕。研究發現，腸道菌群與AD的發病密切相關，因此通過調節腸道菌群來預防和治療AD已成為AD研究的新方向〔4～6〕。伏彩霞等〔7〕發現，AD患者炎癥因子、氧化應激及胰島素抵抗均與其發病密切相關，并且炎癥因子、氧化應激會加重胰島素抵抗，可能促進病情進展。Kocahan等〔8〕發現神經炎癥是AD的病因之一。白藜蘆醇作為葡萄、虎杖等多種天然植物中存在的多酚類化合物，具有多種生物學作用。Miura等〔9〕和Jang等〔10〕發現，白藜蘆醇具有免疫調節、抗氧化、抗衰老等作用，易通過血腦屏障。Ahmed等〔11〕發現白藜蘆醇在AD動物模型中表現出了神經保護作用。然而，目前關于白藜蘆醇通過改善腸道菌群來改善大腦功能的研究尚未見報道。推測白藜蘆醇具有通過調節腸道菌群、減少β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集，從而達到改善大腦認知功能的作用。本文探討白藜蘆醇與腸道菌群、大腦認知功能之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 無特定病原體(SPF)級快速老化模型小鼠(SAMP8)，雄性，8周齡，體重23～28 g，購于至善(北京)健康醫學研究院有限公司，生產許可證SCXK(津)2015-0003。動物普通飼料購于廣東藥科大學實驗動物中心。白藜蘆醇購自Amresco(貨號10102)；硫酸軟骨素：鄭州安安康食品化工有限公司；小鼠Aβ試劑盒購自AndyGene(貨號AD31399MO)；小鼠尿酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號C012-1-1)。

1.2實驗方法

1.2.1動物飼養環境 在室溫為23℃，相對濕度為75%，晝夜明暗交替時間為12 h∶12 h的環境中適應性喂養14 d，自由飲食和飲水。

1.2.2動物分組處理 衰老模型實驗：8周齡SAMP8雄性小鼠適應性喂養1 w后，隨機分為對照(N)組、硫酸軟骨素處理(T)組、硫酸軟骨素+白藜蘆醇聯合處理(CT)組，分別飼喂基礎飼料、基礎飼料+硫酸軟骨素、基礎飼料+硫酸軟骨素+白藜蘆醇。T組和CT組每隔一日灌胃硫酸軟骨素溶液1 g/kg，60 d后在消毒環境下收集小鼠糞便1 g/只。在繼續灌胃硫酸軟骨素的基礎上，對CT組加灌白藜蘆醇45 mg/(kg·d)。N組全程灌胃等量生理鹽水。40 d之后再收集小鼠糞便1 g/只，用于腸道細菌測序分析。在完成行為學測試后，麻醉處死，取大腦組織進行免疫學及生物化學檢測。

1.2.3血清制備 將取得的血液于室溫中凝固30 min，再置于冷凍離心機中，以4℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液。

1.2.4組織勻漿 取出大腦組織稱重后根據重量加入一定量的pH值為7.4磷酸緩沖液(PBS)，置于勻漿器中進行充分的冰浴勻漿。勻漿液置于冷凍離心機中，以4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液，-80℃保存。

1.3分析測試

1.3.1糞菌宏基因組分析 收集糞便后，將樣本送往廣州基迪奧生物有限公司進行糞菌宏基因組分析。16 S核糖體RNA(16 S rRNA)包括了10個保守區域和9個高變區域，其中保守區在細菌間差異不大，而高變區具有屬或種的特異性。所以，16 S rDNA可以成為鑒定物種的特征核酸序列，是最適于細菌進行分類鑒定的指標。

樣品總DNA通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增、產物純化、文庫制備及庫檢、上機測序得到原始數據，再對原始數據進行剪切過濾拼接成Tags，接下來過濾目標片段并聚類成為操作分類單元(OTU)。首先根據得到的總OTU，統計分析其中共有及特有的 OTU，接下來再進行OTU物種注釋，從而得到每個樣品不同水平的群落組成信息。

1.3.2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測衰老模型大腦組織的Aβ 嚴格按照說明書進行操作，重復3次，取各孔的平均吸光度(OD值)。

1.3.3酶比色法檢測衰老模型大腦組織的尿酸含量 嚴格按照說明書進行操作，重復3次，取各孔的平均吸光度(OD值)。

1.3.4Morris水迷宮行為學測試 Morris水迷宮行為學測試包括前6 d的定位航行實驗和第7天的空間搜索實驗，主要用于測試空間學習能力和記憶能力。定位航行實驗歷時6 d，每只小鼠每天訓練4次，每次120 s，平臺停留時間設3 s，隨機選擇一個象限，將小鼠面向池壁放入水中，記錄其尋找平臺所需時間即逃避潛伏期。如在120 s內未找到平臺，將其引至平臺并且停留3～5 s。每只小鼠共計訓練24次，計算每天各組4次逃避潛伏期的平均值。空間搜索實驗用于測量記憶能力。第7天撤去平臺,任選一個標記物將動物放人水中，測量其120 s在目標象限的時間、游泳速度和穿越平臺的次數。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。并選用Graphpad prism軟件完成作圖。

2 結 果

2.1硫酸軟骨素和白藜蘆醇對衰老模型小鼠腸菌組成的影響 由圖1可知，小鼠在接受硫酸軟骨素或硫酸軟骨素+白藜蘆醇處理之后腸道菌群發生了明顯的變化。T組有害的促炎性脫硫弧菌豐度均有不同程度升高。相反，CT組則脫硫弧菌豐度降低。其次，T組CT1小鼠腸道有益的抗炎性梭菌豐度低于CT組CT2小鼠。另外，CT組CT2小鼠抗炎性毛螺菌高于T組CT1小鼠，見圖1。

N為對照組，T1為接受硫酸軟骨素處理60 d；T2為T1再接受硫酸軟骨素40 d；CT1為接受硫酸軟骨素處理60 d；CT2為CT1再接受硫酸軟骨素和白藜蘆醇處理40 d圖1 白藜蘆醇、硫酸軟骨素對衰老小鼠腸道菌群的影響

2.2硫酸軟骨素和白藜蘆醇對SAMP8小鼠行為學測試指標的影響 第3天開始，T組逃避潛伏期明顯高于N組，而CT組逃避潛伏期整體趨勢低于T組，見表1。

在第7天的空間搜索實驗當中，T組平均速度、穿越平臺次數及在目標象限內的時間均低于N組，表明該組小鼠的空間學習能力和記憶能力低于N組。CT組平均速度、穿越平臺次數和在目標象限內的時間均高于T組，說明白藜蘆醇具有提高快速老化模型小鼠學習和空間記憶能力的作用。其中T組平均速度顯著低于N組和CT組(均P<0.05)。見表2。

表1 各組定位航行試驗潛伏期

與N組比較：1)P<0.05;與T組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組空間探索實驗

2.3硫酸軟骨素和白藜蘆醇對衰老模型小鼠大腦Aβ、尿酸水平的影響 T組Aβ、尿酸水平顯著低于N組和CT組(P<0.05)，而CT組Aβ表達及尿酸水平顯著低于N組(均P<0.05)，見表3。

表3 各組尿酸和Aβ比較

3 討 論

大腦認知功能障礙是AD的主要癥狀之一，因該病的難以基本治愈等現狀給家庭和社會造成了沉重的負擔。隨著對腸道菌群研究的逐漸深入，越來越多的研究結果表明腸道菌群與AD密切相關〔12～14〕。梭菌為短鏈脂肪酸(SCFAs)產生菌，在腸道中可產生乙酸、丙酸、丁酸等。研究表明，SCFAs可通過調控Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(My)D88/腫瘤壞死因子相關因子(TRAF)6/核因子(NF)-κB炎癥通路抑制脂多糖(LPS)誘導的小膠質細胞的炎癥反應，而對神經元起到保護作用〔15〕。毛螺菌科在微生物學分類中屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目，Han等〔16〕研究發現毛螺菌科可能通過調節CD4+T細胞內乙酰化組蛋白H3水平，調控Treg的免疫平衡，而Treg細胞在腸道穩定狀態時非常豐富，有助于維持腸道和免疫系統穩定。脫硫弧菌為硫酸鹽還原菌，當其在腸道中大量存在時，會過度降解腸壁黏液素，使腸壁變薄形成腸漏，LPS滲漏入血再透過血腦屏障進入到大腦當中，導致大腦產生感染性炎癥〔17〕。以上結果表明，硫酸軟骨素處理小鼠的促炎性腸菌豐度較高，而抗炎性腸菌豐度較低。相反，經白藜蘆醇處理后，促炎性腸菌豐度降低，抗炎性腸菌豐度升高。

AD在神經病理學上以細胞壁、神經元表面的淀粉樣蛋白沉積與神經纖維纏結為特征，作為老年斑主要成分的Aβ在AD的形成與發展中都扮演著重要的角色。Aβ的前體淀粉樣蛋白(APP)為神經元跨膜蛋白，其作用為促進神經元生長、存活和損傷后修復。Bourgade等〔18〕發現Aβ對單純皰疹病毒(HSV)-1和甲型流感病毒感染大腦有保護作用，Kumar等〔19〕發現Aβ能抗大腦內細菌及真菌感染。當LPS透過血腦屏障進入大腦時，APP被切割產生Aβ用以清除炎癥。然而，Aβ又可以經LPS-TLR4/糖基化終末產物受體(RAGE)雙通路激活小膠質細胞引起神經炎癥，且硝基化動力激素相關蛋白-1和硝基化胰島素降解酶的S-硝基化又使Aβ無法被降解，最終Aβ進入線粒體，引起線粒體功能障礙，釋放過多活性氧簇，使神經元早衰死亡〔20〕。一旦神經元死亡數量超過閾值就會導致AD發生，而神經元死亡是LPS入腦和氧化應激的必然結果。Aβ和尿酸分別與LPS含量及氧化應激程度成正比，本文推測，SAMP8小鼠處于老年狀態，免疫力低下，當用硫酸軟骨素灌胃時，誘導了硫酸脂酶分泌菌及硫酸還原菌過度生長〔21，22〕。在腸道受損條件下，LPS外泄誘發大腦神經炎癥。反之，白藜蘆醇可能通過調整腸道菌群、避免腸壁損傷和脂多糖外漏，減少Aβ生成與聚集，從而發揮改善大腦認知功能的作用。