qseC調控大腸桿菌生物膜形成和體內毒性的機制

蒙俊 陳華梅 羅林 呂欽 楊堃

(昆明醫科大學第一附屬醫院 1心血管外科，云南 昆明 650032；2麻醉科)

大腸桿菌作為人體共生菌、腸道腹瀉菌和腸外致病微生物〔1〕，是社區和醫院獲得性革蘭陰性感染最常見的病原菌之一。尿路致病性大腸桿菌(UPEC)常引起尿路感染(UTIs)，它通常具有特殊的毒力因子(vfs)，如黏附素、毒素、鐵獲取系統和多糖外殼；而共生菌株通常不具有這些特征〔2，3〕。細菌生物膜是導致感染難以控制的根源。有研究表明，能形成生物膜的菌株表現出更強大的溶血素和1型菌毛表達〔4〕。生物膜被定義為一個由細菌細胞組成的結構群落，這些細菌細胞被封閉在自產聚合物基質中，附著在惰性或活性實體表層〔5〕。此外，眾所周知，生物材料的存在有利于細菌生物膜的產生，使與置入材料相關的感染更加難以治療。例如，細菌在導尿管上形成生物膜，這會為細菌定植和感染創造更有利的條件，導致導尿管相關的UTIs〔6〕。UTIs是發達國家主要的公共衛生問題，也是最常見的醫院感染之一〔7〕。大多數UTIs是由大腸桿菌引起的，占社區獲得性UTIs的90%，約占醫院感染性UTIs的50%〔8〕。這些大腸桿菌菌株通常來源于病人自己的腸道菌群。與人體共生大腸桿菌相比，UPEC存在幾種毒力因子，使其能夠定植宿主黏膜(尿道黏膜上皮)，損傷和侵入宿主組織，克服宿主防御機制，激發宿主炎癥反應，最終從下尿路進入腎腔和組織〔9〕。UTIs中涉及的毒力因子包括表面毒力因子，如1型菌毛、P、S和F1C菌毛；分泌型的毒力因子，如α-溶血素、細胞毒性壞死因子(CNF)1、自轉運體毒素(SAT)、細胞致死性擴張毒素(CDT)和細胞溶血素A〔10〕。尿路感染由于復發率高，這些感染有轉變為慢性的趨勢。而大腸桿菌在尿路中的持續存在也可能是前列腺炎反復發作的原因〔10〕。事實上，有研究表明，在急性前列腺炎發作后，1/3的男性在6 w療程結束后的3個月內，前列腺分泌物培養結果仍呈陽性，這可能與細菌形成的生物膜結構有關〔11〕。因為生物膜可以保護細菌不受流體動力、宿主防御機制及抗生素的影響。本研究旨在探討qseC調控大腸桿菌生物膜形成和體內毒性的機制。

1 資料與方法

1.1菌株與質粒 大腸桿菌標準菌株K-12 MC1000菌株，通過基因組測序表明qseC基因完整無缺失，此菌株阿拉伯糖代謝缺陷，有利于Red重組系統。通過基因敲除技術敲除大腸桿菌K-12 MC1000菌株上的qseC基因組(MC1000ΔqseC)，基因組測序表明菌株的qseC基因缺失。所使用的質粒為溫度敏感復制子pKD46，pKD3(一種為PCR擴增提供氯霉素抗性基因的模板，可為重組子提供篩選標志)，pCP20(一種FLP重組酶的表達質粒，為溫度敏感性質粒，用于消除FRT間的氯霉素抗性基因)。

1.2分組 實驗分為兩組，一組為大腸桿菌標準菌株K-12 MC1000菌株，一組為敲除qseC基因組的大腸桿菌K-12 MC1000菌株(MC1000ΔqseC)，每組做6個平行驗證。

1.3研究方法

1.3.1大腸桿菌qsec基因敲除

1.3.1.1引物設計 設計用于擴增氯霉素抗性基因cat的引物P1和P2，此引物靠近5′端的部分序列與qseC兩側基因同源，靠近3′端的部分序列與質粒pKD3上cat兩側基因同源及用于鑒定菌株重組的鑒定引物P3和P4，引物序列如下：P1：GATTTTAGCGGCATTGCATCCGGAATAATGCCAGGAACCC GGAATTAGTTTGCCCATGGGCATACACTGAGTGCC ACTCG、P2：CACATGGCTAGCAGTACGTGGCATTTGAAATTG GCCACCTTGACGTAAACCGTCCTTTA-AACCAGTCAT GAT、P3：ATTTTAGCGGCATTGCATCCGGAACG、P4：CATTTGAAATTGGCCACCTTGACAAT，引物由金維智生物科技有限公司(蘇州)合成。以質粒pKD3為擴增的模板，以P1和P2為擴增引物，其中氯霉素抗性基因的PCR擴增條件如下：①95℃ 120 s，共1個循環；②95℃ 30 s，共1個循環；③55℃ 30 s，共38個循環；④72℃ 60 s，共1個循環；⑤72℃ 600 s，共1個循環。加入Not 1酶使殘留的質粒模板降解，擴增的產物使用凝膠電泳法進行電泳并進行膠回收測序。

1.3.1.2基因敲除 按照文獻提供的方法使用pKD46質粒制備MC1000感受態細胞，取適量的經過PCR擴增的氯霉素抗性基因片段及感受態細胞到電擊杯中，在2 500 V的條件下點擊5 ms，隨后加入到LB培養基中培養，培養后涂于含有氯霉素的LB平板上，37℃培養12 h后，篩選陽性重組子(MC1000ΔqseC：：Cm)，經過PCR技術鑒定。鑒定后，使用帶有氨芐青霉素抗性基因的pCP20質粒去除氯霉素抗性基因，最后得到的就是對氨芐青霉素敏感的菌株就是去掉氯霉素抗性基因的重組子(MC1000ΔqseC)。使用P3和P4鑒定引物對其進行鑒定。

1.3.2測定重組菌株的生長曲線 吸取經過適當條件培養的大腸桿菌MC1000及MC1000ΔqseC菌液(n=6)到新的LB培養基中，在200 r/min的轉速下37℃培養，每隔2 h測定細菌的A600值。

1.3.3酶標法檢測菌株生物膜 在96孔板中加入每組的菌液和液體培養基作為空白對照，37℃的培養箱中培養24 h后，除去菌液，加入200 μl 1%的結晶紫，室溫染色20 min，用去離子水漂洗3次，晾干后加入200 μl 95%的乙醇，在600 nm下檢測吸光度。

1.3.4大腸桿菌菌株總RNA提取 收集培養的大腸桿菌MC1000及MC1000ΔqseC菌液3 ml。按照試劑盒說明書進行RNA提取，提取完后使用核酸測定儀檢測RNA含量及純度，取600 ng的RNA樣品使用1×TAE配制1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察28 S、18 S、5 S三條帶的亮度，泳道上無明顯彌散雜帶。

1.3.5RNA反轉錄與實時熒光定量PCR 將提取的RNA使用康為生物公司提供的反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，反應體系如如下：①2 μl Primer mix；②4 μl dNTP mix；③4 μl 5×RT緩沖液；④2 μl DTT；⑤1 μl Hifiscript；⑥3 μl RNase-free water；⑦4 μl RNA Template，總計20 μl。反應條件：42℃ 45 min，85℃ 5 min，待反應結束后即可得到cDNA，將反轉錄的cDNA采用SYBR Green染色的方法進行實時熒光定量PCR反應，反應體系如下：①12.5 μl SYBP@ Premix Ex TaqⅡ(2×)；②1.0 μl cDNA；③0.5 μl正義引物；④0.5 μl反義引物；⑤10.5 μl ddH2O，總計25.0 μl。反應條件如下：(1)在擴增程序時，①95℃ 30 s，共1個循環；②95℃ 5 s，共40個循環；③60℃ 30 s；④72℃ 60 s。(2)在熔解曲線程序時，①95℃ 15 s，共1個循環；②60℃ 30 s；③60～95℃ 30 s；④95℃ 15 s。采用2-△△Ct計算基因的相對表達量。設計的相關毒性基因及內參引物如下所示：Fim基因:上游:5′-AATGATTGCGATACCACTGTTG-3′;下游:5′-AATGGTTGGTTAACTGTTATTGC-3′，長度為168 bp；hylA基因:上游:5′-AACATGCAAAGCTGTTCTGGCT-3′;下游:5′-ACCAATGCGGTTCATCCCGTCAA-3′，長度176 bp；Usp基因:上游:5′-GATGCAGGTAACCAGTCATGG-3′;下游:5′-CAACTGAAGGTCAAGTCCAGAG-3′，長度 155 bp；16 Sr RNA基因:上游:5′-CCTTTGTATGCARGACTGGGAA-3′;下游:5′-GGTAGCCAAACCTTAGTAACTG-3′，長度 189 bp。由擎科生物有限公司合成。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗，χ2檢驗。

2 結 果

2.1氯霉素抗性基因的PCR擴增及替代qseC基因的結果鑒定 根據方法1.3.1.1中提到的方法進行實驗，電泳結果見圖1，可以看出擴增產物的經過電泳鑒定大小為1 000～1 200 bp，與理論的實際大小相符。同時氯霉素抗性基因替代qseC基因的經過引物P3和P4可以初步的鑒定菌株的基因型，它們理論上在MC1000菌株上的大小為1 488 bp，在MC1000ΔqseC上的大小為1 176 bp，結果見圖2。

圖1 氯霉素抗性基因的PCR產物電泳

圖2 MC1000和MC1000ΔqseC：：Cm鑒定電泳

2.2基因敲除結果 使用鑒定引物對氯霉素抗性消除的克隆進行驗證，驗證結果如圖3所示，MC1000的鑒定引物擴增產物長度為1 100～1 200 bp，去除抗性基因后的MC1000ΔqseC擴增結果在237 bp，與理論值相符，可以看出qseC基因敲除成功。

2.3重組菌株的生長曲線 將大腸桿菌MC1000和MC1000ΔqseC在LB培養基上培養15 h，每3 h測定一次細菌密度，制作生長曲線如圖4所示，從圖中可以看出，MC1000和MC1000ΔqseC的生長曲線幾乎完全重合，這可能說明MC1000和MC1000ΔqseC在LB培養基上的生長無明顯差異。

2.4菌株生物膜檢測 經過結晶紫染色PVC膜培養，通過酶標法檢測發現，MC1000組的生物膜半定量OD值為1.12±0.02，而MC1000ΔqseC為0.59±0.03，兩組差異顯著(P<0.05)。

圖3 MC1000和MC1000ΔqseC鑒定電泳

圖4 菌株生長曲線

2.5毒性機制 與MC1000組菌株中的相關基因相比，MC1000ΔqseC組Fim、hylA及Usp的表達量均明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 MC1000和MC1000△qseC菌株毒力相關基因的 表達水平(2-△△Ct值，

3 討 論

生物膜的形成分為四個步驟：黏附或附著、生物膜結構的早期發展、細胞從生物膜向周圍環境的成熟和分散及回到浮游狀態。生物膜的形成涉及幾個因素，例如：鞭毛和運動性。運動型大腸桿菌通常有多個鞭毛，細菌通過運動在宿主生物體或靶器官的上定殖，并進一步與表面接觸。菌毛是致病性大腸桿菌致病性因子之一〔12，13〕。其中，1型菌毛在大腸桿菌最初附著在非生物表面過程中具有重要作用〔14〕。自身轉運蛋白是跨細胞質和細胞外膜到細菌細胞表面的分泌蛋白〔15〕。在這些蛋白質中，Ag43通過細胞間握手機制形成Ag43-Ag43相互作用，促進細胞聚集〔16，17〕；aidA和tibA是黏附素，參與彌漫性黏附。共軛菌毛F-菌毛通過非特異性附著到非生物表面及隨后的細胞間接觸促進初始黏附和生物膜成熟，從而穩定生物膜的結構〔17，18〕。細菌生物膜的基質由胞外多糖組成，這種基質是一個水合物黏性層結構，形成這種結構的細菌無法被免疫系統識別，可保護嵌入式細菌免受干燥和宿主防御〔19〕。

有研究表明，大腸桿菌qseC可感應識別微生物分泌產生的AI-3信號和宿主產生的腎上腺信號。在感知到這些信號后，qseC自磷酸化，然后將其磷酸轉移到qseB，qseB隨后調節自身轉錄及鞭毛和運動基因的轉錄。然后，大腸桿菌利用其運動裝置附著到宿主黏膜上皮并開始感染〔20〕。觀察到一個qseC缺失突變體在家兔感染模型中因毒力減弱，進一步強調了這種信號系統在細菌發病機制中的作用。qseC作為細菌腎上腺素能受體，通過感應細菌激素樣化合物和宿主激素來連接細菌和宿主。值得注意的是，qseC與腎上腺素能受體不具有一級序列同源性，因此，它可能是這些G蛋白耦聯受體的功能性類似物，而不是同源物〔21，22〕。qseC受體蛋白廣泛存在于志賀菌屬、沙門菌屬、流感嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等細菌中〔23〕。最近報道認為，生物膜的形成可能與UTIs細菌毒力基因密切相關。據報道，從前列腺炎、腎盂腎炎和UTIs患者血液中分離出的大腸桿菌菌株中，PAPC、SFA/FOCDE和CNF1(但非FIMH)比從健康受試者的直腸拭子中分離出的大腸桿菌菌株更為普遍〔24，25〕。生物膜形成能力與UPEC菌株的特異性毒性決定因子(pap、sfa/focode、hlya、cnf1、sat和鐵)之間存在著良好的相關性。fim基因被認為是促進黏附、侵襲和生物膜生長的重要因素；表達該基因的菌株屬于msha型。

本研究結果說明qseC基因可以使大腸桿菌的生物膜形成受到阻礙。qseC調控大腸桿菌的毒力可能是通過調控fim、hylA及Usp的表達來實現的。