PMA-LAMP法可視化檢測乳中沙門氏菌

王冠蕾

（承德石油高等專科學校，河北承德067000）

0 引言

沙門氏菌（Salmonella）是世界上最常見的食源性致病微生物之一，能夠引起人類和許多其他動物疾病，如人腸胃炎、傷寒病、敗血癥等[1]。隸屬于腸桿菌科，能運動，無芽孢，兼性厭氧，革蘭氏呈陰性。沙門氏菌菌屬類型多樣，抗原復雜，基于O抗原和H抗原，目前已分離出2 500多個血清型，且生物體高度多樣化，并仍在演變。作為一種最常見的細菌性病原體，可以通過棲息環境、飼養過程以及水源傳播，并通過原料乳、肉類或蛋類等動物源性食物的不恰當烹飪或加工過程而傳染人類[2-4]。研究報道，嬰兒配方奶粉（Powdered infant formula，PIF）是沙門氏菌感染嬰兒的主要途徑[5]。因此，沙門氏菌的污染及其在PIF中快速檢測方法是關注和研究的熱點之一。

目前分子生物學檢測技術逐漸廣泛應用于食源性致病菌的檢測中，成為了一種新型的快速鑒定方法并具有一定的優勢。其中，環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于其簡單、快速、檢測線低等特點，應用范圍逐漸拓寬，具有較大的發展前景[6-8]。LAMP技術的研發是由日本Notomi博士利用體外擴增核酸的原理[9]，設計4～6條LAMP引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，一定的恒溫條件可引發自動循環鏈置換反應，對DNA進行循環擴增，從而達到快速擴增目標核酸片段的目的，其已經被用于食品中沙門氏菌的檢測[10-12]。對于產物的檢測，可利用羥基萘酚藍（hydroxy naphthol blue，HNB）染料預先添加到反應體系中進行可視化檢測，HNB根據溶液反應前后p H值的不同而產生顏色變化，陽性結果為天藍色，陰性結果為紫羅蘭色，從而用肉眼即可對結果進行觀察判斷。整個過程避免了開蓋檢測，因此不會產生假陽性結果，也不需要專門的檢測設備，經濟實用并適合于現場快速檢測，與LAMP技術的結合在近年內被廣泛關注和應用[13-16]。但由于LAMP方法的高檢測靈敏度，能同時擴增樣品中的死菌和活菌的DNA，易造成高估樣品中活菌的水平和假陽性結果。美國Biotium公司研發的熒光染料—疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）具有幾乎完全細胞膜不滲透性，可以選擇性的結合從死細胞中暴露出來的DNA，而遠離未受損傷的活細胞中完整的DNA，從而有效地用于死/活菌的區分[17-19]。

本研究建立一種以熒光染料PMA與LAMP快速檢測技術相結合的方法，以沙門氏菌siiA基因為特異性靶標，同時結合HNB可視化檢測方法，用于快速、準確的檢測PIF中沙門氏菌，為食品中致病菌的檢測開辟一個新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗所用菌株見表1。使用的主要試劑有：引物，北京諾賽基因組研究中心有限公司；PMA，美國Biotium公司；LB培養基，青島海博生物有限公司；2×Taq PCR MasterMixTaq，北京天根生物技術有限公司；Bst2.0 DNA Polymerase，New England Biolabs公司；MgSO4，New England Biolabs公司；d NTPs，北京天根生物技術有限公司；羥基萘酚藍（HNB），美國Sigma-Aldrich公司。

表1 試驗用菌株及其來源和LAMP檢測結果

1.2 儀器與設備

移液器，Eppondorf公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DYY-10C型電泳儀，上海安亭科學儀器廠；UVP凝膠成像系統，美國UVP公司；電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；ZHWY200B型恒溫培養搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；精密電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.3 方法

1.3.4 HNB染料的優化及可視化檢測體系的建立

1.2.4 裸鼠移植瘤模型構建 取對照組、陰性組、干擾組CaSki細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液將細胞消化，1000 g離心10 min，把上清溶液吸棄，添加PBS，將細胞配制成每毫升含有4×107細胞的單細胞懸浮液，吸取300 μL注射至裸鼠右側后腿皮下，裸鼠均出現移植瘤。分別在接種CaSki細胞后7、12、17、22、27 d測量腫瘤體積，腫瘤體積=（長徑×短徑2）÷2。在最后1次測量腫瘤體積后，脫臼法將裸鼠處死，取腫瘤組織，稱取腫瘤質量。

九條“高壓線”遲恒條條碰，說是碰，又像是在上面走鋼絲，平衡功夫似乎不錯，因為迄今為止，被他捅到的那些部門，只有來求情的，沒有來問罪的，至少說明一點，也是很重要的一點，此人穩重。

1.3.2 DNA的提取

在花生的生長過程中，如何更好的發揮出單粒精播的優勢，是我國農戶和科研人員都在思考的一個問題。本文通過對花生種植過程中種子處理、整地翻地、田間管理等方面進行分析，希望可以為農戶以及研究人員提供一些參考。

4.4.2 搭建網絡交流平臺。利用網絡虛擬平臺，進行教師實踐指導、學生分組討論和實踐成果分享，引領學生在理解與合作的情感狀態下開展綜合實踐活動；拍攝環境生態工程綜合實習視頻，整合理論教學過程中已有的專題實踐教學內容資源(圖片、視頻、網頁等)，進行網絡分享；通過網絡進行教師與學生、學生與學生之間的實踐互動(如經驗分享、個案解析、成果展示等)。

1.3.3 引物的設計與LAMP擴增

隨著互聯網與移動終端的緊密結合，從電子商務到互聯網金融，每時每刻都在產生大量的數據。傳統的風險分析方式已不能適合金融機構的業務，數據挖掘技術對多維度、大數據的智能、批量處理，更貼合信息化時代的風控要求。金融投資行業越來越多地采用機器學習、數據挖掘的方法進行風險評估。大數據已經成為金融機構加強風險控制的重要手段。然而，實際采集得到的數據中，各種類數據樣本的分布并不均勻，使得某些類型的數據被淹沒在巨量數據中，影響數據分析結果的準確性。因此如何充分利用采集得到的數據，對于準確有效的風險預測分析，顯得尤為重要。

本研究針對沙門氏菌保守序列siiA基因（STM 4257，在NCBI中的序列號為：NC_003197）[20]，利用在線軟件PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html），設計4條LAMP引物，包括外引物F3、B3和內引物FIP、BIP。引物序列見表2。

采用25μL LAMP擴增體系進行反應，分別對引物比例、試劑濃度、反應溫度和時間進行優化，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）在紫外燈下觀察擴增結果，選擇最優條件對提取的DNA進行LAMP擴增。

1.3.1 菌株的培養與保藏

用去離子水將HNB粉末稀釋為1.5 mmol/L濃度的母液并進行分裝，于-20℃下避光儲存備用。之后優化LAMP體系中HNB染料的濃度，調整其母液的添加量使體系中終濃度分別為90、120、150、180、210 μmol/L，并進行LAMP擴增反應，以2μL雙蒸水代替DNA作為陰性對照。根據陽性結果顯示天藍色，陰性結果顯示紫色的情況選擇HNB的最佳濃度。從而建立針對沙門氏菌的LAMP-HNB可視化檢測體系。

1.3.5 菌液的PMA處理

在20 mL LB液體培養基中，以2% 的接種量加入凍存菌液，于37℃、200 r/min的條件下培養8 h，并重復一次對菌液進行二次活化。之后經LA固體培養基活化后，挑取單菌落在相同條件下培養8 h，以獲得對數生長期末期的菌種，用于后續試驗。取上述菌液750μL加入凍存管，再加入250μL 80% 甘油，無菌條件下將液體混勻并密封，置于-20℃冰箱中保藏。

據葉靄玲說，當白麗筠去拉房地產大鱷森達房地產公司李老板的存款時，被李老板招了安，成為身家上億的李老板的小三，順便在李老板的公司當了售樓小姐。這里的主次關系是與白麗筠的講述顛倒的。我不知道究竟該相信哪一個版本，但是所謂兼聽則明，兩方面都聽到，事實真相基本上就清楚了。

PMA溶解于二甲亞砜（DMSO）中，配制成1 mg/mL的PMA溶液，-20℃黑暗處保存。取1 mL制備好的菌懸液置于2 mL離心管中，加入PMA溶液至終濃度為3μg/mL，混勻后在室溫條件下避光培養5 min，然后放置在距離光源20 cm處，利用650W鹵素燈曝光5 min，為了防止溫度過高應將樣品放在冰上進行交聯，交聯后的懸浮液于13 000×g離心5 min，得到的沉淀用于后續試驗。本研究采用95℃熱處理3 min殺死菌體，然后分別取1 mL活菌液和死菌液，經PMA處理后用于DNA提取和LAMP檢測，同時分別取1 mL未經PMA處理的活菌液和死菌液作為對照。

表2 LAMP引物及序列

1.3.6 特異性驗證

1.3.7 純培養物靈敏度檢測

應用構建好的PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法，針對14株沙門氏菌和9株非沙門氏菌進行特異性驗證，觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶的有無和添加HNB的體系顏色變化，判斷檢測方法的特異性。每個菌株均做三組平行試驗。

選取鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028作為標準菌株進行培養，并用0.85% 的生理鹽水將菌液進行10倍梯度稀釋并涂布計數，確定其活菌濃度，使目標菌濃度范圍在107～10-1CFU/mL之間，之后加入固定濃度的死菌，經PMA處理后提取不同濃度菌液的DNA進行LAMP擴增，利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分別對2μL產物進行靈敏度檢測。

本研究利用一步法快速提取細菌基因組DNA。取300μL細菌培養液于2 mL EP管中，12 000×g離心2 min，棄去上清液，向沉淀中加入300μL DNA提取液（25% Chelex-100，p H=8.0），混勻后于95℃下水浴10 min，再冰浴3 min，然后12 000×g離心2 min，取上清液（即為DNA）并于-20℃冰箱中儲存。

1.3.8 嬰兒配方奶粉靈敏度檢測

將購買的嬰兒配方奶粉按照FDA建議的常規檢驗法進行檢測，以確定奶粉中完全不含有沙門氏菌[21]。然后取10 g奶粉溶于90 mL無菌的蛋白胨水溶液中，均勻混合，分別加入不同稀釋度的純培養菌液，以獲得沙門氏菌的終濃度范圍在107～10-1CFU/g之間的人工污染PIF樣品。經PMA處理后，提取奶樣中沙門氏菌的基因組DNA進行LAMP擴增，并利用LAMP-AGE和LAMP-HNB法分別對2μL產物進行靈敏度檢測，以確定檢出限。同時，與傳統PCR方法作比較。

醫療損害糾紛案件中由于專業所限，常需要對患者的損傷程度、診療行為與損害結果是否存在因果關系等專門性問題進行鑒定，以使法官更深入地了解案情，便于做出公正的裁判。侵害患者知情同意權責任糾紛案件亦有許多需要進行鑒定之處，但部分判決書對于鑒定部分的闡述過于簡單，使人難以清楚了解鑒定的事項。在這些判決書中，對于鑒定意見進行總結書寫僅僅一句帶過，使閱讀者僅能知悉醫院是否有過錯，承擔責任的輕重，難以進一步了解其他信息，比如有判決書的表述為：“結論為該爭議屬于一級甲等醫療事故，醫院承擔輕微責任。”[12]未明確說明為何認定醫院承擔輕微責任以及醫院應承擔責任的具體比例，僅以“輕微”二字概括，過于簡略。

10月22日，中國工會十七大在北京勝利召開。大會主題：以習近平新時代中國特色社會主義思想為指導，堅持走中國特色社會主義工會發展道路，忠誠黨的事業，竭誠服務職工，團結動員億萬職工為決勝全面建成小康社會、奪取新時代中國特色社會主義偉大勝利而奮斗！向全會上下發出號令，提出要求。此時此刻，重溫、學習、領會、踐行習近平關于工人階級和工會工作的重要論述，對于把建設有中國特色社會主義工會偉大事業不斷推向前進，具有重大的現實意義和深遠的歷史意義。

2 結果與分析

2.1 LAMP體系的確定

通過對LAMP體系中各組分及反應條件的優化，建立了最佳的LAMP反應條件：采用25μL體系，含有0.2μmol/L外引物F3/B3、1.6μM內引物FIP/BIP、1.8 mmol/L d NTPs、2.5μL 10×ThermoPol Buffer、4 mmol/L MgSO4、0.9μL Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase（8 u/μL）和2μL模板DNA，加入雙蒸水至25μL。將體系置于65℃反應45 min，80℃條件下2 min終止反應。

2.2 羥基萘酚藍染料添加量的確定

LAMP體系的HNB優化結果如圖1所示。陰性對照組呈紫色，當HNB的濃度為90μmol/L和120 μmol/L時，陽性反應體系未變色，仍顯示紫色，當HNB的濃度不低于150μmol/L時，陽性反應體系呈現天藍色，因此HNB染料的最佳終濃度為150μmol/L，可實現LAMP-HNB可視化檢測沙門氏菌。

2.3 PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法的建立

圖1 HNB濃度的優化

PMA作為一種分子染料，只能穿過已死亡細菌的細胞膜（壁），在光激發后能與DNA共價結合，從而阻斷其擴增反應。為了證明PMA-LAMP可視化方法能夠選擇性只擴增活菌從而進行驗證試驗，結果如圖2所示。泳道2至泳道4均有LAMP擴增條帶，而泳道5未出現LAMP擴增結果。說明PMA-LAMP方法能夠有效地抑制死菌的擴增，使其只檢測活菌，防止假陽性結果的產生。同時LAMP-HNB檢測結果與電泳結果一致，說明利用HNB染料進行可視化檢測的可行性。因此，PMA-LAMP-HNB可視化檢測沙門氏菌的方法成功建立。

圖2 PMA-LAMP-HNB方法的建立

2.4 可視化檢測方法的特異性驗證

針對全部34株菌株，經PMA處理后，LAMP擴增產物的兩種檢測方法結果如表1所示，對所有14株沙門氏菌的AGE和HNB可視化檢測結果均為陽性，而對所有的20株非沙門氏菌的擴增結果均為陰性。因此證明PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法對沙門氏菌具有特異性。

2.5 純培養物的檢測靈敏度

沙門氏菌純培養物靈敏度的檢測結果如圖3所示，通過平板計數以確定沙門氏菌的濃度范圍為4.6×107CFU/mL至4.6×10-1CFU/mL。對 于PMA-LAMP擴增產物的檢測結果，AGE和HNB染料法的結果表現一致。在對照組顯示陰性的情況下，當純培養物活菌的濃度在4.6×107CFU/mL至4.6×101CFU/mL時，檢測結果均為陽性，而在100CFU/mL和10-1CFU/mL濃度時均呈現陰性。因此PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法對于沙門氏菌活菌的檢測靈敏度為4.6×101CFU/mL，與AGE檢測靈敏度相同。

圖3 沙門氏菌純培養物的靈敏度

2.6 人工污染乳中沙門氏菌的檢測靈敏度

PIF中沙門氏菌靈敏度的檢測結果如圖4所示，通過平板計數以確定人工污染乳中沙門氏菌活菌的濃度范圍為6.3×107CFU/g至6.3×10-1CFU/g。當目標菌濃度在6.3×107CFU/g至6.3×101CFU/g時，電泳結果出現LAMP擴增典型的T型條帶，帶HNB染料的體系均呈現陽性結果的天藍色，此時對照組呈現陰性結果，說明LAMP-HNB檢測法靈敏度為6.3×101CFU/g，而PCR-AGE法的靈敏度為6.3×103CFU/g。因此，PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法對于PIF中沙門氏菌活菌的檢測靈敏度與AGE檢測靈敏度相同，是傳統PCR方法的100倍。

圖4 嬰兒配方奶粉中沙門氏菌的靈敏度

3 結論

本研究基于沙門氏菌siiA基因設計4條LAMP引物，在65℃恒溫條件下擴增45 min，通過預先向體系中添加150μmol/L HNB染料，實現對擴增產物的可視化檢測。同時利用3μg/mL PMA熒光染料對菌液進行預處理，防止假陽性結果，達到檢測活菌的目的，從而建立一種針對嬰兒配方奶粉中沙門氏菌的PMA-LAMP-HNB可視化檢測方法。總檢測時間不超過1 h 30 min，對純培養物和人工污染PIF中沙門氏菌的檢測靈敏度分別為4.6×101CFU/mL和6.3×101CFU/g，與LAMP-AGE檢測靈敏度相同，是傳統PCR檢測方法的100倍。此方法具有強特異性和高靈敏度，不需要使用精密昂貴的試驗設備，操作簡單，可應用于其他微生物檢測、診斷等領域。