乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)技術(shù)分析

李孟婕

摘 要：關(guān)于乳制品中黃曲霉素M1的檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)，包括對(duì)高效液相色譜儀的測(cè)定條件就進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定相關(guān)系數(shù)等方式。本文對(duì)可以替代現(xiàn)有黃曲霉素M1免疫親和柱的液液萃取方法進(jìn)行了建立，對(duì)合適的萃取條件及萃取液進(jìn)行了優(yōu)選，進(jìn)而確保操作方法更加簡(jiǎn)便。

關(guān)鍵詞：乳制品;黃曲霉素;M1;檢測(cè)

前言

作為一組與化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，已經(jīng)在目前的情況下分離鑒定出AFM1、AFB1等多達(dá)12種，AFM1和AFB1是通過(guò)羥基化作用而在動(dòng)物體內(nèi)形成的一種代謝產(chǎn)物。在AFB1飼料被污染后，一旦奶牛攝入了這些飼料，就會(huì)在牛奶中有一部分AFB1轉(zhuǎn)化為AFM1。而由于AFM1屬于黃曲霉素的一種，對(duì)熱、光、酸都比較穩(wěn)定，常規(guī)的方法對(duì)其的效果都較差。因此，本試驗(yàn)優(yōu)化AFM1的檢測(cè)方法，以此確保檢測(cè)工作的順利進(jìn)行。

1準(zhǔn)備試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料的選擇包括試驗(yàn)設(shè)備和試驗(yàn)試劑，試驗(yàn)設(shè)備包括電子天平（AUY220型）、12孔位、氮吹儀（BGC-12A型）、雙頻數(shù)顯、高效液相色譜儀（LC1260）、高速臺(tái)式離心機(jī)（GT10-1型）、FLD熒光檢測(cè)器、WH漩渦微型混合儀。

試劑的選擇包括優(yōu)級(jí)純乙腈、優(yōu)級(jí)純丙酮、優(yōu)級(jí)純甲醇、優(yōu)級(jí)純二氯甲烷、優(yōu)級(jí)純?nèi)燃淄椤⒎治黾兟然c;其中的試驗(yàn)用水應(yīng)為去離子水。純度99%的黃曲霉素M1標(biāo)準(zhǔn)品。

2運(yùn)用試驗(yàn)方法

2.1處理樣品

在檢測(cè)純牛奶的過(guò)程中，應(yīng)進(jìn)行樣品前處理，純牛奶的前處理，在50ML的離心管中取2g液態(tài)奶，并在其中加入0.5g氯化鈉和18ML乙腈，在經(jīng)過(guò)12min，35℃的超聲后，經(jīng)過(guò)10min，6000r/min的離心反應(yīng)，然后，取5ML濾液在離心管中，并取上清液過(guò)0.5um唯恐濾膜，并在其中加入有機(jī)微孔濾膜。同時(shí)，在加入5ml二氯甲烷以后，利用1min進(jìn)行漩渦震蕩，再10min以6000/min離心，取1ML下層溶液將溶劑吹干，并將1ml甲醇加入以此對(duì)其復(fù)溶。就乳粉的前期處理來(lái)說(shuō)，可以將1.5ML去離子水在0.5g乳粉中加入進(jìn)行水復(fù)溶，純牛奶的前處理步驟也可以參考本方案。

2.2測(cè)定與制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

分配黃曲霉素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行分別配制，使其成為濃度分別為1ng/ml，0.75ng/ml，0.5ng/ml，0.25ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在經(jīng)過(guò)上機(jī)測(cè)定以后，可以將峰高設(shè)置為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度設(shè)置為橫坐標(biāo)。其方程式為0.00032+0.01304x=Y，er0.9995則為其相關(guān)系數(shù)。

2.3萃取與凈化試劑

乳制品中會(huì)含有較多的脂類(lèi)和豐富的蛋白質(zhì)，可以選擇氮化鈉、乙腈、丙酮作為試劑進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，也可以將其用于對(duì)大分子物質(zhì)的沉降方面，旨在確保熒光對(duì)其的干擾得以降低。由于丙酮具有較高的熒光本低值，會(huì)在一定程度上對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性產(chǎn)生影響，因此，需要通過(guò)使用乙腈對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步凈化。在選擇乙腈方面，可以對(duì)檢測(cè)乳制品中的三聚氰胺的方法進(jìn)行參考，而選擇氯化鈉則可以參考測(cè)定擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥分組的模式來(lái)進(jìn)行。在選定凈化試劑后，應(yīng)選擇萃取劑，三氯甲烷和二氯甲烷都是具有一定作用的物質(zhì)，但是相比二氯甲烷來(lái)說(shuō)，三濾甲烷的毒性較強(qiáng)，因此，選擇二氯甲烷作為萃取劑是比較合適的一種方式。

2.4選擇樣品稱(chēng)樣量

在進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，應(yīng)對(duì)稱(chēng)樣量進(jìn)行設(shè)定，并在回收率的影響與稱(chēng)樣量變化的關(guān)系進(jìn)行研究。在進(jìn)行實(shí)際方面，可以分別取乳粉1g，0.5g，0.1g;取純牛奶5g，2g，1g進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)。同時(shí)，值得注意的是，應(yīng)對(duì)稱(chēng)樣量的數(shù)量進(jìn)行確保，稱(chēng)樣量數(shù)量過(guò)小，不僅會(huì)影響回收率的檢測(cè)，同時(shí)也會(huì)對(duì)萃取、凈化造成影響，同時(shí)也會(huì)影響到萃取后溶液的純凈度，因此，在進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)的過(guò)程中，也應(yīng)將19ML乙腈在稱(chēng)好的1g液體乳中加入，并與濃度為10ng/ML的1ML的混合液設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品;將18ML乙腈在稱(chēng)取好的2g液體乳中加入，并與濃度為10ng/ML的混合液設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品;將15ML已經(jīng)加入稱(chēng)取好的5g液體乳中，并與濃度為10ng/ML的混合液設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品，然后，在這種情況下對(duì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作。

2.5選擇超聲時(shí)間

在進(jìn)行黃曲霉素M1的檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)超聲波提取技術(shù)進(jìn)行運(yùn)用，可以對(duì)毒素的擴(kuò)散及溶解形成促進(jìn)作用。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)，可以將溫度調(diào)節(jié)在30℃，在這種條件下將單一變量設(shè)定為超聲時(shí)間，并將超聲時(shí)間分別設(shè)定為12min，10min，8min。通過(guò)試驗(yàn)后，得出一個(gè)結(jié)論，將超聲時(shí)間設(shè)定為10min，是較為合適的試驗(yàn)時(shí)間。進(jìn)而，從結(jié)果中可以得出一個(gè)結(jié)論，由于超聲時(shí)間控制不當(dāng)也會(huì)在很大程度上對(duì)回收率形成影響，這是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)降低超聲效率，而時(shí)間過(guò)短又不利于待測(cè)組的擴(kuò)散與溶解。

2.6選擇離心條件

在其他條件不變的情況下，可以將離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為單一變量，可以將離心轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為8000r/min，6000r/min，4000r/min，然后分析測(cè)定不同轉(zhuǎn)速的回收率。在轉(zhuǎn)速加大后，很有可能會(huì)對(duì)萃取效果產(chǎn)生影響，因此，本試驗(yàn)決定將離心轉(zhuǎn)速選擇為6000r/min，然后，在確定離心轉(zhuǎn)速后，設(shè)置單一變量為離心時(shí)間，在離心轉(zhuǎn)速過(guò)高的情況下，會(huì)發(fā)生沉浸，而在離心轉(zhuǎn)速過(guò)低的情況下，也沒(méi)有提供萃取效率，并且，通過(guò)試驗(yàn)表明，在離心回收率最高的10min的情況下進(jìn)行試驗(yàn)其效果最為明顯。

3檢測(cè)結(jié)果

3.1曲線(xiàn)線(xiàn)性檢驗(yàn)結(jié)果

在乳制品中黃曲霉素M1的檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)員應(yīng)分別在乳粉和純牛奶中按照1ug/kg，0.75ug/kg，0.5ug/kg，0.25ug/kg的水平中將黃曲霉素M1的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，然后，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程進(jìn)行繪制并測(cè)定。經(jīng)過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化純牛奶的曲線(xiàn)圖譜及逆向測(cè)定，可以得出0.00038+0.01319X=Y，同時(shí)其相關(guān)系數(shù)為0.9979，而乳粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)其回歸方程式為0.00054+0.01565X=Y為其回歸方程式，并且其相關(guān)系數(shù)為0.9951。通過(guò)上述測(cè)定可以得出一個(gè)結(jié)論，黃曲霉素M1的測(cè)定與本乳制測(cè)量方法相符合。

3.2檢驗(yàn)精密度

在進(jìn)行黃曲霉素M1的試驗(yàn)過(guò)程中，在空白樣品中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液方法進(jìn)行運(yùn)用，而且，還應(yīng)測(cè)定同一日期的相同濃度的樣品，并且應(yīng)保證測(cè)定的次數(shù)應(yīng)達(dá)到10次以上。而就乳粉與純牛奶的添加量也應(yīng)保證相同劑量，可以在0.5ug/kg。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可以得知，RSD在>1.9%，<2.85%的范圍內(nèi)，其檢測(cè)的精密度較高，因此也有利于定量分析黃曲霉素M1。

3.3檢出限檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)可知，回收率在>91.1%，<104.4%的范圍內(nèi)，波動(dòng)范圍較小且回收率的穩(wěn)定性最強(qiáng)，因此也可以較為精準(zhǔn)的分析檢測(cè)物。此外，將黃曲霉素M1的信噪比按照3倍來(lái)測(cè)算，可以檢出限為0.05ug/kg，這種情況較比我國(guó)目前規(guī)定的乳制品中黃曲霉素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)要低。因此，可以明確的是，此方法的檢測(cè)結(jié)果較為精準(zhǔn)，并且，也可以確保檢測(cè)結(jié)果的肯定值。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在本試驗(yàn)中對(duì)黃曲霉素M1的檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)也應(yīng)優(yōu)化分析高效液相普條件以及其前后處理結(jié)果。本試驗(yàn)方式可以更加充分的將乳制品中的黃曲霉素M1的污染水平進(jìn)行反映，并對(duì)回收試驗(yàn)進(jìn)行運(yùn)用，對(duì)凈化液與萃取液進(jìn)行優(yōu)化，證明與檢測(cè)要求相符合，同時(shí)，對(duì)牛乳制品中的黃曲霉素M1的檢測(cè)較為合適。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉佳盟，趙慧芬，高星，張雪林，常碩，水明，蘇燊.優(yōu)化牛乳制品中黃曲霉毒素M1檢測(cè)方法的研究[J].中國(guó)奶牛，2016（12）：45-48.

[2]李燕俊.乳與乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)方法（綜述）[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，1998（02）：3-5.

（遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)（沈陽(yáng)）有限公司實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110121）