磁共振波譜技術(shù)測(cè)定中國人群血脂亞組分的初步探討

藺亞暉，楊瓊，蘇保滿，康金鎖，周洲

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（ASCVD）仍是威脅中國居民生命的“頭號(hào)殺手”，且近年來我國ASCVD 患病人數(shù)始終處于上升趨勢(shì)[1]。血脂異常是ASCVD 的九大危險(xiǎn)因素之一，2016 年《中國成人血脂異常防治指南》推薦甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測(cè)為血脂基本篩查指標(biāo)[2]，并將LDL-C 作為ASCVD 和糖尿病預(yù)警、用藥指導(dǎo)和降脂監(jiān)測(cè)工作中最為核心的檢測(cè)指標(biāo)。然而，研究發(fā)現(xiàn)LDL-C 水平僅能解釋50%的ASCVD[3]，脂蛋白電泳發(fā)現(xiàn)，血脂中低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等常規(guī)血脂指標(biāo)仍能細(xì)分為多種亞組分。另一方面，脂蛋白顆粒的數(shù)量與粒徑與ASCVD具有顯著相關(guān)性，粒徑越小、顆粒數(shù)越多具有極度的致動(dòng)脈粥樣硬化作用。相同LDL-C 濃度下，其包含的血脂亞組分具有差異。因此，進(jìn)一步研究血脂亞組分的特征將有助于評(píng)估ASCVD 風(fēng)險(xiǎn)，并有可能成為干預(yù)的靶標(biāo)。

磁共振波譜技術(shù)（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS）是光譜學(xué)的一個(gè)分支，在強(qiáng)磁場(chǎng)中帶核磁性的分子或原子核吸收電磁輻射從低能態(tài)向高能態(tài)躍遷過程中產(chǎn)生共振譜，經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)學(xué)模型的數(shù)字轉(zhuǎn)換，用于測(cè)定混合物中成分的數(shù)目、類型和相對(duì)位置。1990 年，NMRS 首次被用于血脂成分的檢測(cè)，隨后被標(biāo)準(zhǔn)化并用于臨床血脂亞組分譜的檢測(cè)。其原理主要是通過NMRS 檢測(cè)磷脂、未酯化膽固醇、膽固醇酯和TG 末端甲基集團(tuán)的質(zhì)子數(shù)量。血脂顆粒內(nèi)核中酯化膽固醇和TG 各含三個(gè)末端甲基，表面的磷脂和未酯化膽固醇各含有兩個(gè)末端甲基集團(tuán)。NMRS 通過檢測(cè)四類末端甲基質(zhì)子數(shù)量，確定脂蛋白亞組分的質(zhì)量、顆粒數(shù)和粒徑等特征，可對(duì)LDL 平均粒徑、以及極低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）亞型及各亞型中脂類分布進(jìn)行定量檢測(cè)[4]，美國糖尿病管理指南推薦NMRS 作為血脂亞組分檢測(cè)的三種方法之一[5]。但是，在中國臨床應(yīng)用中尚未見相關(guān)正常參考范圍的報(bào)道。

本研究首先對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的性能進(jìn)行驗(yàn)證，隨后建立基于NMRS 的中國健康人群血脂亞類指標(biāo)的正常參考范圍，為NMRS 血脂檢測(cè)在國人健康預(yù)警、精細(xì)選藥及ASCVD 療效監(jiān)測(cè)等臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究人群

本研究已通過阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2017-877），共包含1 091 例研究對(duì)象，其中包含2018 年10 月到2019 年4 月間納入的691 例主訴無動(dòng)脈硬化性心血管疾病的健康體檢人群以及400例隨機(jī)抽取的阜外醫(yī)院住院患者。691 例健康人群的納入標(biāo)準(zhǔn)為：≥18 歲；血壓正常[未經(jīng)服藥情況下收縮壓＜140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；舒張壓＜90 mmHg]；肝腎功能正常；空腹血糖＜6.1 mmol/L（未經(jīng)服藥）；常規(guī)血脂指標(biāo)中TC、TG 不高于正常參考上限；HDL-C 不低于正常參考下限；LDL-C ≤3.4 mmol/L（未經(jīng)服藥）。排除標(biāo)準(zhǔn)為：有心腦血管疾病史；孕婦；服用任何調(diào)整血脂、血壓、血糖藥物的個(gè)體；4 周內(nèi)發(fā)生重大疾病或入院者。691 例健康人群按照性別分組，用于建立男性和女性的NMRS 各項(xiàng)血脂指標(biāo)的正常參考范圍，400 例心血管疾病患者用于比較不同血脂分布下NMRS 與常規(guī)生化檢測(cè)方法的相關(guān)性和性能學(xué)驗(yàn)證。

1.2 樣本處理

常規(guī)生化檢測(cè)：研究對(duì)象空腹8 h，采集血液于含惰性分離膠的血清管中，放置至血液充分凝固后3 000 rpm 離心10 min，取上清檢測(cè)。所用儀器為美國貝克曼AU5811 全自動(dòng)生化分析儀，血脂項(xiàng)目檢測(cè)原理：TC、TG、LDL-C、HDL-C 為酶比色法，載脂蛋白A1（Apo-A1）和載脂蛋白B（Apo-B）為免疫比濁法。

NMRS 檢測(cè)：采集研究對(duì)象全血2 ml（空腹8 h、含EDTA-K2抗凝劑的BD 采血管），1 500 g 離心10 min，轉(zhuǎn)移上層血漿到凍存管中，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。檢測(cè)時(shí)，將樣本從冰箱中取出，等待完全解凍后，取400 μl 血漿與NMRS 血脂緩沖液（美國布魯克Bruker Biospin）1 :1 混合，充分混勻后置于5 mm 核磁管中，載入自動(dòng)進(jìn)樣器中等待檢測(cè)。

1.3 NMRS 血脂檢測(cè)及檢測(cè)項(xiàng)目

依據(jù)AVANCE IVDr 磁共振波譜儀系統(tǒng)（美國布魯克Bruker Biospin）的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)[6]，并采用配套軟件Topspin 對(duì)原始數(shù)據(jù)解析，使用TSP（trimethylsilylpropanoic acid）及1.48 ppm 處的丙氨酸雙峰信號(hào)對(duì)化學(xué)位移進(jìn)行校正；使用0.8 ppm 及1.25 ppm 處的脂蛋白鏈-CH3及-CH2-信號(hào)群的積分對(duì)脂蛋白各亞類進(jìn)行定量。最終NMRS 血脂檢測(cè)將VLDL 分為5 個(gè)亞組分（VLDL-1～5），LDL 分為6個(gè)亞組分（LDL-1～6），HDL 分為4 個(gè)亞組分（HDL-1～4），以及粒徑及顆粒數(shù)量。

1.4 NMRS 血脂檢測(cè)平臺(tái)穩(wěn)定性評(píng)估

圖1 20 次等份樣本一氫磁共振波譜圖中脂蛋白亞類信號(hào)區(qū)域

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)的指南（Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI）規(guī)定，對(duì)NMRS 血脂檢測(cè)平臺(tái)的方法學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。取20 例患者的EDTA 血漿各0.5 ml 進(jìn)行混合，混合均勻后等量分裝為20 管，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中，每次取出一管、每日2 次（每次間隔8 h）、連續(xù)10 天對(duì)等分樣本重復(fù)進(jìn)行前處理及NMRS 掃描檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用MedCalc 15.2.2 軟件統(tǒng)計(jì)分析。NMRS 血脂定量檢測(cè)的穩(wěn)定性通過計(jì)算相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的20 個(gè)重復(fù)檢測(cè)值的變異系數(shù)（CV，%）進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用一元線性回歸分析NMRS 血脂檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)值的相關(guān)性，通過決定系數(shù)（R2）對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。取不同組別健康人群的NMRS 血脂檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取所有檢測(cè)值的95%CI 統(tǒng)計(jì)不同性別血脂指標(biāo)正常參考范圍，并使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)對(duì)不同組別進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NMRS 血脂檢測(cè)平臺(tái)穩(wěn)定性評(píng)估

本研究通過TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B 6 項(xiàng)血脂指標(biāo)的重復(fù)檢測(cè)證實(shí)NMRS 譜圖在20 次檢測(cè)中的重復(fù)性好（圖1A、1B），6 項(xiàng)血脂指標(biāo)的批間變異系數(shù)在1.39%～2.62%之間（表1）。

表1 6 項(xiàng)常規(guī)血脂指標(biāo)平均值及變異系數(shù)

2.2 NMRS 血脂檢測(cè)與臨床常規(guī)生化方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果之間相關(guān)性

對(duì)NMRS 方法與常規(guī)生化方法所共有的6 項(xiàng)臨床血脂檢測(cè)指標(biāo)（TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B）的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性研究，兩種方法學(xué)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一元線性回歸，得到的相關(guān)性曲線（圖2A～F ）。在400 例患者的NMRS 檢測(cè)結(jié)果中，統(tǒng)計(jì)了6 項(xiàng)臨床血脂檢測(cè)指標(biāo)的最大值、最小值以及各指標(biāo)90%人群落在的區(qū)間范圍（表2），兩種方法學(xué)所檢測(cè)的數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)（R2）在0.927～0.978 之間。

2.3 中國人群NMRS 血脂亞組分檢測(cè)正常參考范圍（表3、表4、圖3）

圖2 400 例樣本中磁共振波譜技術(shù)與常規(guī)生化方法學(xué)6 項(xiàng)共有臨床血脂檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性曲線

表2 400 例患者的磁共振波譜技術(shù)檢測(cè)結(jié)果中6 項(xiàng)指標(biāo)的最大值、最小值以及各指標(biāo)90%人群落在的區(qū)間范圍相關(guān)性

表3 691 例健康人群基線資料（±s）

表3 691 例健康人群基線資料（±s）

表4 不同血脂亞類的參考范圍

依據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)入選的691 例健康人群基線資料（表3）。NMRS 檢測(cè)的常規(guī)血脂指標(biāo)（TC、TG、Apo-A1、Apo-A2、Apo-B100、LDL-C、HDL-C）、LDL 顆粒平均粒徑、VLDL、LDL、HDL 組分的顆粒數(shù)以及5 個(gè)VLDL 亞組分（VLDL-1～5）、6個(gè)LDL 亞組分（LDL-1～6）、4 個(gè)HDL 亞組分（HDL-1～4）的TC 和TG 濃度的總體正常參考范圍詳見表4。

LDL平均粒徑、VLDL、IDL、LDL 總體及LDL 各亞組分顆粒濃度在健康人群中的分布情況詳見圖3。

圖3 LDL 平均粒徑及亞組分顆粒濃度在健康人群中的分布情況

性別亞組分分析顯示，男性和女性LDL 顆粒平均粒徑呈偏態(tài)分布，其中位數(shù)分別為20.3 nm 和20.5 nm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。男性VLDL和IDL 顆粒濃度顯著多于女性（中位數(shù)：148 nmol/L vs 106 nmol/L；51 nmol/L vs 42 nmol/L；P＜0.001）；不同性別的LDL 顆粒濃度無顯著差異，但是LDL 亞組分中，LDL-1、LDL-2 和LDL-3 在男性中顯著低于女性，中位數(shù)分別為178 nmol/L vs 199 nmol/L、148 nmol/L vs 169 nmol/L、180 nmol/L vs 197 nmol/L（P均 ＜0.001）；LDL-4 顆粒濃度在不同性別中無顯著差異（中位數(shù)：196 nmol/L vs 190 nmol/L；P＞0.001）；與之相反，女性LDL-5 和LDL-6 顆粒濃度中位數(shù)分別為155 nmol/L、240 nmol/L，顯著低于男性（中位數(shù)：206 nmol/L、316 nmol/L）。

VLDL 亞組分中，男性VLDL-1～4 中TG 含量顯著高于女性，中位數(shù)分別為29.9 mg/dl vs 14.5 mg/dl、13.1 mg/dl vs 8.15 mg/dl、11.9 mg/dl vs 9.17 mg/dl、7.6 mg/dl vs 7.1 mg/dl；相反，男性VLDL-5 中TG 含量顯著低于女性，中位數(shù)為2.0 mg/dl vs 2.2 mg/dl。男性VLDL 各亞組分TC 含量中除VLDL-5 外，VLDL-1～4 TC 含量均顯著高于女性，中位數(shù)分別為5.2 mg/dl vs 2.6 mg/dl、2.9 mg/dl vs 1.7 mg/dl、3.9 mg/dl vs 2.6 mg/dl、3.4 mg/dl vs 2.7 mg/dl。

LDL 亞組分中，男性LDL-1～3 中TC 含量顯著低于女性，中位數(shù)分別為19.5 mg/dl vs 21.1 mg/dl、14.8 mg/dl vs 16.9 mg/dl、16.9 mg/dl vs 19.5 mg/dl（P＜0.001）；LDL-5 和LDL-6 中TC 含量（中位數(shù)：16.2 mg/dl vs 12.9 mg/dl 和 21.3 mg/dl vs 17.2 mg/dl）為男性高于女性；而LDL-4 TC 含量在男性和女性中相似（中位數(shù)：18.0 mg/dl vs 18.5 mg/dl）。LDL-1～6 中TG含量與之相似，中位數(shù)分別3.8 mg/dl vs 4.0 mg/dl、1.8 mg/dl vs 2.1 mg/dl、1.3 mg/dl vs 1.5 mg/dl、1.8 mg/dl vs 1.9 mg/dl、2.0 mg/dl vs 1.6 mg/dl、3.1 mg/dl vs 2.6 mg/dl。

HDL 亞組分中，男性HDL-1～3 中TC 含量顯著低于女性，中位數(shù)分別為12.7 mg/dl vs 17.0 mg/dl、6.6 mg/dl vs 9.0 mg/dl、8.8 mg/dl vs 10.5 mg/dl（P＜0.001）；而HDL-4 中TC 含量中男性高于女性（中位 數(shù)：21.3 mg/dl vs 20.4 mg/dl；P＜0.001）。HDL 亞 組分中僅有HDL-1、HDL-4 中TG 含量在不同性別間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中HDL-1 中TG 含量男性低于女性（中位數(shù)：2.6 mg/dl vs 3.1 mg/dl；P=0.008），HDL-4 中TG 含量男性高于女性（中位數(shù)：3.4 mg/dl vs 2.9 mg/dl；P＜0.001）。

3 討論

本研究首先通過對(duì)TG、TC、LDL-C、HDL-C、Apo-A1、Apo-B 6 項(xiàng)常規(guī)血脂指標(biāo)的重復(fù)性檢測(cè)，顯示NMRS 方法具有很好的重復(fù)性，隨后與臨床常規(guī)生化方法學(xué)檢測(cè)之間相關(guān)性研究顯示NMRS 方法檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法具有很好的一致性，最后建立了中國人群LDL 顆粒平均粒徑、VLDL、LDL、HDL 組分的顆粒數(shù)以及5 個(gè)VLDL 亞組分、6 個(gè)LDL 亞組分、4 個(gè)HDL 亞組分的TC 和TG 濃度的正常參考范圍，性別亞組分分析顯示，大部分在男性和女性間具有差異，最好采用性別特異性參考范圍。

LDL-C 雖然作為各血脂指南管理的核心指標(biāo)，但是仍不能代表所有人群的ASCVD 風(fēng)險(xiǎn)[7]。一項(xiàng)針對(duì)約13 萬例冠心病住院患者血脂水平的分析顯示，近半數(shù)的住院冠心病患者LDL-C 水平正常[3]；另一基于6 814 例ASCVD 患者檢測(cè)數(shù)據(jù)研究顯示，LDL-C與LDL 顆粒濃度在同一患者中并不協(xié)同變化，LDL顆粒較LDL-C 更能反映心血管疾病（CVD）風(fēng)險(xiǎn)[8]。在針對(duì)2 072 例CVD 患者脂蛋白亞組分的分析研究中，提示LDL-C 達(dá)標(biāo)的ASCVD 患者是由于致病亞組分升高，揭示亞組分分析能提供進(jìn)一步的預(yù)警；2012 年，美國臨床內(nèi)分泌醫(yī)師協(xié)會(huì)將脂蛋白亞組分檢測(cè)寫入《血脂異常和動(dòng)脈粥樣硬化預(yù)防管理指南》，提出臨床醫(yī)生對(duì)于血脂參數(shù)雖然達(dá)標(biāo)但動(dòng)脈粥樣硬化仍繼續(xù)惡化的患者，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行脂蛋白亞組分分析；并在2017 年將LDL 顆粒濃度列為附加風(fēng)險(xiǎn)因素[9]。越來越多的證據(jù)表明檢測(cè)血脂顆粒的重要性，而NMRS 血脂檢測(cè)是滿足LDL 顆粒和亞組分血脂檢測(cè)的重要方法之一。

大數(shù)據(jù)研究表明，使用貝特類（吉非貝齊、非諾貝特）、吡格列酮、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制劑類藥物或與他汀類聯(lián)合用藥以降低ASCVD 事件發(fā)生率[10-12]。將NMRS 提供的LDL 顆粒監(jiān)測(cè)指標(biāo)應(yīng)用于臨床，能出具以檢驗(yàn)學(xué)為基礎(chǔ)的選藥依據(jù)。因而，NMRS 血脂檢測(cè)不但能進(jìn)一步評(píng)估ASCVD 風(fēng)險(xiǎn)，還有利于實(shí)現(xiàn)臨床調(diào)脂治療的個(gè)體化合理用藥[13]。

根據(jù)LDL 平均粒徑的大小可以對(duì)LDL 進(jìn)行區(qū)分，粒徑較大、密度較低（粒徑20.6～22.0 nm）的LDL顆粒被定義為A 型（Pattern A），顆粒較小、密度較大（粒徑19.0～20.5 nm）的為B 型（Pattern B）[14-15]，而以B 型LDL 為主的人群中ASCVD 事件出現(xiàn)頻率較A 型人群高出3 倍以上，因而評(píng)估LDL 平均粒徑對(duì)ASCVD 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要臨床意義[16]。LDL 平均粒徑在不同性別的健康人群中均隨著年齡的增大而減小，且在不同年齡段的女性中呈現(xiàn)顯著性差異，預(yù)示著更高的CVD 風(fēng)險(xiǎn)。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究入選的隊(duì)列雖然排除了服用調(diào)整血脂、血糖藥物的個(gè)體，但是未記錄一些與代謝相關(guān)的藥物使用情況，例如已知甲狀腺功能減退患者的TC 和LDL-C 水平顯著升高，同時(shí)大尺寸LDL 和HDL、小尺寸VLDL 濃度水平均增加[17]。另一方面，雌激素水平與雌激素替代治療法可增加HDL-C 和Apo-A1 水平而降低LDL-C 和TG 水平[18]。在多囊卵巢綜合征患者中，也發(fā)現(xiàn)雖然LDL-C水平無顯著變化，但是小尺寸LDL顯著升高[19]。其次，本研究選擇的健康人群，雖然已經(jīng)考慮了常規(guī)血脂、血糖、肝腎功、心腦血管病史等常規(guī)因素，但是尚缺乏心臟或頸動(dòng)脈超聲、影像學(xué)證據(jù)等，以進(jìn)一步排除表觀隱匿性動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。因此，本研究所獲數(shù)據(jù)僅可作為中國表觀健康人群血脂亞組分的參考數(shù)據(jù)。目前，本課題組已經(jīng)啟動(dòng)增加影像學(xué)證據(jù)和確切藥物服用史的健康人群篩選研究，以最終建立血脂亞組分的確切參考區(qū)間。

近年來，血脂檢測(cè)越來越多的將研究目標(biāo)指向血脂指標(biāo)的亞組分，而NMRS 血脂檢測(cè)在提供目前臨床指標(biāo)的同時(shí)，出具大量亞組分?jǐn)?shù)據(jù)是血脂臨床研究的利器[20]。本研究建立了中國人群不同性別的NMRS 血脂檢測(cè)正常值范圍，能夠?yàn)楦哐獕骸⑻悄虿　⒎逝趾臀鼰煹染哂蠥SCVD 危險(xiǎn)因素的人群提供更敏銳的血脂預(yù)警，NMRS 血脂檢測(cè)的特色指標(biāo)也能夠?qū)σ鸦加蠥SCVD 的患者提供有效的用藥指導(dǎo)與全面的療效監(jiān)測(cè)，為NMRS 血脂檢測(cè)在ASCVD 預(yù)警、疾病管理領(lǐng)域的臨床應(yīng)用做了基礎(chǔ)準(zhǔn)備。