褪黑素減輕大鼠頸動脈球囊損傷后炎性細胞浸潤

楊根歡 汪 巖 廖鵬志 賈玉龍

隨著經濟的進步和人群膳食結構的改變，動脈粥樣硬化的發生呈現出年輕化的趨勢。因而血管相關性疾病的發生率越來越高，尤其是心腦血管疾病已成為重要的致死、致殘的原因之一。動脈粥樣硬化最基本的病理變化便是炎性細胞浸潤[1]。褪黑素在體內分布廣泛，相對分子質量較小，可以自由通過細胞膜性結構[2]。已有研究表明，褪黑素具有強大的抗炎和抗氧化功能[3]。本研究表明，褪黑素能夠抑制炎性細胞浸潤過程中相關炎性因子的表達，進而減輕球囊損傷誘導的實驗大鼠頸動脈內炎性細胞的浸潤。

材料與方法

1.材料與試劑：SPF級雄性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，褪黑素(美國Sigma公司)，免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，NF-κB抗體(美國CST公司)，MCP-1抗體(美國Santa Cruz公司)；ICAM-1抗體和VCAM-1抗體(中國博士德生物工程有限公司)。

2.球囊損傷模型的制備及動物實驗：20只SPF級的雄性SD大鼠，平均體質量為350g。隨機將實驗大鼠分為正常對照組、正常并注射褪黑素組、球囊損傷組、球囊損傷并注射褪黑素組，每組5只。將實驗大鼠麻醉后行頸部正中切口，解剖出頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈并套線備用，將頸外動脈的遠端及其分支結扎。將頸總動脈和頸內動脈阻斷，將頸外動脈用顯微剪刀剪開，將2F的取栓球囊插入頸總動脈內約2cm。將0.05ml的0.9%NaCl注射液注入取栓球囊內，充盈后拖至頸總動脈的遠端，如此反復3次，隨后行頸外動脈的斷端結扎，逐層縫合頸部切口。按照預定實驗設計定時對各組實驗大鼠分別行腹腔內注射褪黑素(5mg/kg)及同體積的0.9%NaCl注射液，每日1次[4]。14天后取出各組實驗大鼠的球囊損傷段頸動脈。0.9%NaCl注射液將頸動脈沖洗干凈，將頸動脈一分為二，分別保存于4%的多聚甲醛和液氮中，用于后續實驗。

3.免疫組織化學染色：常規方法對石蠟切片進行脫蠟及水化，檸檬酸鹽抗原修復液浸泡后行高壓、高溫修復抗原，室溫下用3%過氧化氫溶液孵育10min以滅活內源性的過氧化物酶，然后室溫下用5%的山羊血清封閉30min。一抗4℃下孵育過夜(CD45 1∶50)，二抗室溫下孵育60min。DAB法染色，陽性表達為棕黃色。終止染色后用蘇木精復染5min，0.1%鹽酸乙醇分化3～5s，自來水沖洗返藍2min，然后常規進行脫水、透明、封片。將免疫組織化學的切片置于光學顯微鏡下拍照(×400)，用Image-Pro Plus 6.0軟件對CD45陽性區域的平均吸光度值進行分析，將相應數值用于統計分析。

4.Western blot法檢測：將大鼠的頸動脈標本加入600μl SDS組織裂解液，置于研缽中，研磨成組織勻漿，常規方法提取組織蛋白并測定蛋白濃度。將總量為20μg的蛋白上樣，120V的恒壓下電泳約90min，320mA的恒流下進行轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h，4℃下一抗孵育12h(NF-κB 1∶2000,MCP-1 1∶2000,ICAM-1 1∶500，VCAM-1 1∶500)，TBST洗膜3次，在室溫下二抗(濃度1∶5000)孵育1h，之后應用辣根過氧化物酶化學發光法檢測目標蛋白。用Alpha EaseFC system 軟件(美國Alpha Innotech公司)對Western blot法檢測結果進行分析，分別測量目標蛋白和相應內參的灰度值，將其比值用于統計學分析。

結 果

1.各組實驗大鼠的頸動脈壁內炎性細胞的浸潤情況：球囊損傷組實驗大鼠的頸動脈壁內炎性細胞的浸潤程度顯著高于正常對照組實驗大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實驗大鼠的頸動脈壁內炎性細胞的浸潤程度顯著低于球囊損傷組實驗大鼠(P<0.01，圖1)。

圖1 各組實驗大鼠的頸動脈壁內炎性細胞浸潤情況(CD45免疫組化染色，×400)A.正常對照組；B.正常+褪黑素組；C.球囊損傷組；D.球囊+褪黑素組；E.與正常對照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.01

2.各組實驗大鼠的頸動脈內NF-κB的表達情況：球囊損傷組實驗大鼠的頸動脈內NF-κB的表達顯著高于正常對照組實驗大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實驗大鼠的頸動脈內NF-κB的表達顯著低于球囊損傷組實驗大鼠(P<0.01，圖2)。

圖2 各組實驗大鼠的頸動脈內NF-κB的表達與正常對照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.01

3.各組實驗大鼠的頸動脈內MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達情況：球囊損傷組實驗大鼠的頸動脈內MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達顯著高于正常對照組實驗大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實驗大鼠的頸動脈內MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達顯著低于球囊損傷組實驗大鼠(P<0.05，圖3)。

圖3 各組實驗大鼠的頸動脈內MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表達與正常對照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.05

討 論

隨著人類的疾病譜的改變，社會對血管疾病的認識和重視程度也越來越高。而炎癥作為一重要的病理生理過程參與了很多常見血管病的發生，甚至在某些血管病中可以作為最主要的病理改變，如動脈粥樣硬化、多發性大動脈炎和白塞病等[5,6]。褪黑素作為體內重要的內分泌物質，能夠被體內很多器官合成。褪黑素具有調節人體的生物節律、調節腸道的功能、抑制腫瘤的生長、抗炎性損傷和抗氧化損傷等重要生理功能[7,8]。目前國內外普遍將褪黑素應用于調節人體睡眠及腸道生理功能方面，效果顯著且無明顯的毒性不良反應。已有研究表明，在很多血管疾病中褪黑素具有重要的血管保護作用，如尼古丁誘導的血管病、低氧所致的血管損害以及高血壓相關的血管損傷等[4,9]。

炎癥的本質是炎性細胞的浸潤，即血管壁內炎性細胞的浸潤程度能夠反映其炎性損傷的程度[10]。CD45是組織內炎性細胞的重要標志物之一，因此本研究通過檢測實驗大鼠頸動脈內的CD45陽性細胞數目來反映其炎性細胞的浸潤程度及炎性損傷的程度[11]。大鼠頸動脈球囊損傷可引起動脈內膜的增生和動脈壁的炎性反應，因此本研究用此經典動物模型研究褪黑素對動脈壁內炎性細胞浸潤的影響。結果表明，球囊損傷能明顯誘導實驗大鼠頸動脈壁內的炎性細胞的浸潤，而褪黑素可以抑制此炎性細胞的浸潤。同時本研究尚對褪黑素抑制實驗大鼠頸動脈壁內炎性細胞浸潤的機制進行了探討。

MCP-1是組織內炎性細胞的重要趨化因子之一，VCAM-1和ICAM-1是組織細胞間重要的黏附因子[12～14]。因此MCP-1、VCAM-1和ICAM-1均能夠參與炎性細胞向血管壁的黏附和浸潤。而NF-κB作為重要的炎性因子則能夠誘導MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達[15,16]。結合本研究結果可以推斷，褪黑素能夠通過抑制NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達進而減輕球囊損傷誘導的實驗大鼠頸動脈壁內的炎性細胞浸潤。有研究表明，將大鼠的松果體切除后，發現其主動脈內MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達顯著升高，這與本研究的結果類似[17]。同時本研究也顯示，褪黑素在治療炎癥相關的血管病方面具有潛在的臨床應用價值。