CalothrixinB衍生物對白血病K562細胞的抑制作用及機制*

龍群， 肖瀟， 宋晶睿， 饒青， 劉晟， 何志旭， 李艷梅**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫教研室 & 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 3.貴州省中國科學院 天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

白血病是一組以造血干細胞異常增殖和分化受阻為特點的血液系統惡性腫瘤，分為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocyte leukemia, ALL)及慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CML)，其中AML和CML是常見的白血病惡性血液病[1-2]。人類白血病細胞系K562是一種造血祖細胞，已被廣泛用于CML的研究，它是由一名CML患者建立的細胞系[3-4]。CML是一種以費城(Ph)染色體為特征的骨髓增生性疾病，分為慢性期、加速器和急變期，在美國，CML在成人中約占新診斷疾病的15%[5]。Ph染色體是由22號染色體長臂易位到9號染色體長臂上，使斷點簇區域激酶(breakpoint cluster region kinase,BCR)基因與Abelson激酶(abelson kinase,ABL)基因形成融合基因，編碼的BCR-ABL融合蛋白可以激活多種下游信號通路，如信號轉導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)、蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，從而抑制造血祖細胞分化，導致細胞過度增殖和抵抗凋亡，并破壞遺傳穩定性[6-7]。目前已經有很多藥物被開發用來治療CML，其中酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是一項重要的發現，尤其是伊馬替尼的使用，CML已成為一種可控制的、長期存活率超過85%的慢性疾病[8]。然而在臨床中，由于BCR-ABL突變、BCR-ABL過表達及其他獨立于BCR-ABL的信號通路存在，大約15%～20%的CML患者最終會形成對伊馬替尼的耐藥性，然后進入加速階段，最后達到急變期[9-10]；而一旦CML患者發展到無法控制的程度，治療會更加困難[11]，因此對CML的治療依然需要不斷的研究探索。CalothrixinB是一種具有潛在抗增殖活性的眉藻藍細菌次生代謝產物，它不僅對人HeLa細胞具有納摩樂級的生長抑制作用，而且在體外還能抑制抗氯喹瘧原蟲的生長，但是其對髓系白血病細胞活性較差，經過修飾改造后又可有較好活性[12-13]。本實驗室合成了一系列CalothrixinB的衍似物，通過篩選，本研究選出了L20(圖1) 這個對K562細胞株具有活性的化合物，采用該化合物處理K562細胞，觀察處理后K562細胞的細胞凋亡及細胞周期的變化進一步研究其抑制K562細胞增殖的作用機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及主要儀器

人慢性髓系白血病K562細胞株來自于美國ATCC細胞庫。用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，于37 ℃、5% CO2、濕度為95%的恒溫箱中進行孵育。L20是由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室劉晟老師合成，分子量為 462 kD，化學式如圖1，純度大于 95%的一個CalothrixinB 衍生物。RPMI1640培養基購于美國Giboc公司，胎牛血清購于美國VACCA 公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于 Sangon 生物技術公司，細胞濃度的DMSO、四唑鹽(MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide])試劑、細胞周期染料(propidium iodide, PI)、BCA(bicinchoninic acid) 蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液(immunol precipitation, IP)、蛋白酶抑制劑(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)和彩虹245光譜蛋白Marker (11-245kD) 購于北京索萊寶公司，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購于BD 公司，RNA酶抑制劑購于日本Takara公司，活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購于北京碧云天公司。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, BCL-2)(ab 32124)、B淋巴細胞瘤-2相關X(BCL2-Associated X, BAX)(ab 32503)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)(ab 131450)、 磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶1(phosphorylation-cyclin-dependent kinases 1, p-CDK1) (ab 47594)抗體購于Abcam公司，細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cyclin 25 homolog C,Cdc25C)(4688)、 磷酸化細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(Phosphorylation-cell division cyclin 25 homolog C, p-Cdc25C)(9528)、剪切的Caspase3 (9662)、Caspase 9(9502)、多聚 (腺苷二磷酸核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)(9542)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated,ERK)(4695)和細胞外調節蛋白激酶(phosphorylation-extracellular regulated,p-ERK)(4370)購于CST公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(301341) 購于中國正能。細胞培養箱(3111)，超凈工作臺(1384型 A2型)購于美國Thermo公司，倒置顯微鏡(Axio Vert A1)購于美國ZEISS公司，多功能酶標儀(Synergy 2Multi-ModeReader)購于美國BioTek公司，流式細胞儀(NovoCyte 2040R)購于美國ACEA公司。

圖1 化合物L20的結構和分子量Fig.1 Structure and molecular weight of compound L20

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測K562細胞存活率 將處于對數期生長的K562細胞鋪于96孔板中,細胞濃度為6 000個/孔，體積為90 μL。L20濃度分別按10.00、5.00、2.50、1.25、0.63 mmol/L倍比稀釋，DMSO為對照組，每個濃度同時做5個重復。在每孔中分別加入10 μL稀釋后的藥物 ，拍勻后置于恒溫箱中培養72 h。用普通光學顯微鏡拍取 細胞形態后， 在每孔中加入 MTT 10 μL，混勻后繼續放入溫箱中孵育4 h，用3 000 r/min離心30 min，輕輕將上清吸盡，然后每孔中加入 DMSO 160 μL ，置于搖床上，37 ℃、150 r/min搖15 min；待結晶完全溶解后，用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值(OD)。然后用公式計算各濃度藥物對K562細胞的抑制率：抑制率=(對照組A490 nm-治療組A490 nm)/對照組A490 nm×100%。

1.2.2Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡 將處于對數期生長的K562細胞均勻鋪于6孔板中，每孔的細胞濃度為10×107/L，體積為2 mL。每孔加入2 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養24 h，48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗2遍后，再用1×Binding buffer 50 μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC和PI 2.5 μL，混勻后避光染色15 min，然后離心去染料，1×Binding buffer 200 μL重懸后用艾森 NovoCyte 流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期 將處于對數期生長的K562細胞以50×107/L 鋪于60 mm×60 mm的皿中，體積為3 mL，每皿中加入3 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養24 h后收集細胞，用預冷的PBS洗2遍，再加入500 μL預冷70%乙醇，-20 ℃過夜。離心去除乙醇，再用預冷 PBS 洗2次，然后在每管中加入 500 μL 細胞周期染液[RNaseA (100 mg/L)+PI(50 mg/L)+Triton X-100(0.2%)]混合物。混勻后避光，37 ℃孵育20 min。離心去除染料，再用預冷PBS洗兩次，然后用200 μL PBS重懸，過濾后用艾森 NovoCyte 流式細胞儀對細胞周期進行檢測。

1.2.4ROS的檢測 為了研究L20誘導K562細胞凋亡與線粒體的損傷有關，本研究用活性氧試劑盒來檢測細胞內氧化應激的水平。將處于對數期生長的K562細胞以50×107/L鋪于60 mm×60 mm的皿中，每皿3 mL，每皿加入濃度3 μL分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養24 h后收集細胞，按試劑盒說明書進行探針裝載，然后用熒光顯微鏡進行拍照觀察。

1.2.5Western蛋白印跡 將處于對數期生長的K562細胞以50×107/L鋪于60 mm×60 mm的皿中，每皿3 mL。每皿加入3 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，以DMSO為對照組。37 ℃培養24 h收集細胞，用預冷的PBS洗2遍，加入細胞裂解液(IP ∶PMSF=100 ∶1)，混勻置于冰上30 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確定上樣量。然后用5×SDS buffer，95 ℃變性6 min。取50 μg樣品進行SDS-PAGE 電泳，220 mA，120 min 轉到PVDF 膜上，然后用3%的BSA封閉1 h，4 ℃過夜敷一抗，1×TBS 洗3遍，室溫敷二抗1 h，1×TBS 再洗3遍，然后用Odyssey 紅外成像系統進行掃膜。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 L20對K562細胞增殖抑制的影響

MTT結果顯示，K562細胞經L20(10.00、5.00、2.50、1.25及0.63 μmol/L)處理 72 h后，與DMSO組比較，L20組抑制率隨濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，通過計算，L20對K562細胞的半抑制濃度(IC50)為(5.46±3.09)μmol/L(圖2A)。普通顯微鏡下觀察結果顯示，K562細胞經L20處理72 h后，與DMSO組比較，L20組(10.00、5.00、2.50及1.25 μmol/L)K562細胞數量減少、形態發生變化，并有細胞死亡碎片產生(圖2B)。

注：A為L20(10.00、5.00、2.50、1.25及0.63 μmol/L) 對K562細胞作用72 h的抑制率，B為L20(10、5、2.50、1.25及0.63 μmol/L) 對K562細胞作用72 h后細胞形態的改變，放大倍數(×200 )；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖2 化合物L20對K562細胞增殖的抑制作用(72 h)
Fig.2 Growth inhibition of K562 cells effected by compound L20(72 h)

2.2 L20對 K562細胞凋亡的影響

結果顯示，L20(10.00、5.00、2.50 μmol/L)分別處理K562細胞24 h和48 h后，與DMSO組比較，L20組K562細胞凋亡率隨濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

2.3 L20對 K562細胞周期的影響

結果顯示，L20(10.00、5.00、2.50 μmol/L)作用于K562細胞24 h后，與DMSO組比較，L20組K562細胞處于G2/M期的比例隨濃度的增加而增加(P<0.01)，處于G1期和S期的K562細胞則隨濃度的增加而減少(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

2.4 L20對K562細胞ROS的影響

結果顯示，L20(10.00、5.00、2.5 μmol/L)作用于K562細胞24 h后，與DMSO組比較，加藥組顯示綠色熒光的細胞數變多并且熒光強度增加，說明L20可以增加ROS在K562細胞中的累積。見圖5。

注：A為流式細胞儀分析的凋亡結果，B為凋亡率統計圖。與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖3 L20對K562細胞作用24 h、48 h時的細胞凋亡率
Fig.3 Apoptosis of K562 cells effected by compound L20 after 24 h and 48 h

注：A為流式細胞儀分析的周期分布結果，B為細胞周期統計圖。與DMSO組同周期比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖4 L20對K562細胞作用24 h時的細胞周期變化
Fig.4 Cell cycle of K562 cells effected by compound after 24 h

注：箭頭所示為陽性細胞。

圖5 L20作用于K562細胞24 h后對ROS的影響(熒光染色，×400)
Fig.5 ROS of K562 cells effected by compound L20 after 24 h(microscope，×400)

2.5 L20對K562細胞凋亡和周期蛋白的影響

L20對K562細胞凋亡和周期蛋白影響的結果顯示，K562細胞經L20處理24 h后，與DMSO組比較，磷酸化ERK減少，抗凋亡蛋白BCL-2表達減少，促凋亡蛋白BAX表達增加，剪切的Caspase 9、Caspase 3和PARP均增加(圖6-A)；細胞周期相關蛋白磷酸化CDK1和總的CDC25C增加，磷酸化CDC25C減少(圖6-B)。

注：A為凋亡相關蛋白，B為周期相關蛋白

圖6 L20作用于K562 24 h后對凋亡周期蛋白的影響
Fig.6 Expression levels of apoptosis-and cyclin-related proteins of K562 cells effected by compound after 24 h

3 討論

本研究結果顯示，與對照組DMSO比較，化合物L20作用于K562細胞后，抑制率隨著濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，且在顯微鏡下觀察到細胞數量減少，說明L20能夠抑制K562細胞的增殖；凋亡率隨著濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，細胞周期被阻滯在G2/M期的比例也隨濃度的增加而增加(P<0.01)，說明L20可以誘導K562細胞凋亡并將細胞周期阻滯在G2/M期；化合物L20作用于K562細胞后，細胞內ROS增多，提示L20誘導K562細胞凋亡與線粒體相關；在蛋白水平上，磷酸化ERK減少，調控凋亡及G2/M期的相關蛋白表達也發生了變化，進一步揭示了L20誘導K562細胞凋亡和阻滯細胞周期的機制。

腫瘤的發生是由于基因突變使細胞增殖與死亡之間的穩態被破壞從而導致腫瘤細胞不可控制的生長，因此在研究抗腫瘤藥物時，通常將凋亡和周期阻滯作為抗腫瘤的兩大指標[14-15]。凋亡由線粒體和死亡受體兩條途徑介導，其中BCL-2家族成員是調節線粒體凋亡途徑的重要蛋白，包括促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL-2[16-17]。BAX的增加和BCL-2的減少可以在線粒體上形成小孔道，使線粒體中的細胞色素C釋放到胞漿，細胞色素C又能激活執行凋亡程序的Caspase 3、Caspase 9，使剪切的Caspase 3和Caspase 9增多，最終DNA修復酶PARP被Caspase3裂解，使剪切的PARP增多[18-19]。另外，線粒體中活性氧的堆積也會使線粒體膜電位發生改變，使線粒體膜通透性增加，致使細胞色素C從線粒體中釋放出來[20]。從本研究的結果可看出，L20抑制了抗凋亡蛋白BCL-2的表達，并增加促凋亡蛋白BAX的表達及ROS的產生，提示L20誘導K562細胞凋亡與ROS參與的線粒體凋亡途徑相關。有文獻報道p-CDC25C下調可以抑制CDK1/CyclinB1復合體的活性，CDK1/CyclinB1復合體的激活是調控細胞周期從G2期進入M期的關鍵復合物，其報道還稱細胞內p-CDK1和CyclinB1的積累是無活性CDK1/CyclinB1復合物存在的證據[21]，因此化合物L20通過下調p-CDC25C的活性來抑制CDK1/CyclinB1復合體的活性使細胞周期阻滯在G2/M期。

ERK/MAPK通路被認為是經典的MAPK信號級聯，它在腫瘤發生過程中發揮重要作用，包括調節細胞生長、分化、增殖、凋亡和轉移等多種生物學功能[22-23]。在CML K562細胞中由于BCR-ABL融合基因的表達，使MAPK通路異常激活，并且有研究證明ERK1/2 MAPK通路的異常激活與CML患者的生存和耐藥具有密切聯系[24-25]，因此抑制ERK的活性對CML的治療也有十分重要的意義，說明L20有成為抗腫瘤藥物的潛能。

綜上所述表明，L20可以通過抑制ERK/MAPK通路，調控BAX/BCL-2的表達及ROS的生成來誘導K562細胞經線粒體途徑凋亡，并通過下調p-CDC25C活性來抑制CDK1/CyclinB1復合體的活性將K562細胞阻滯在G2/M期，從而發揮抗腫瘤增殖活性，說明CalothrixinB衍生物L20有希望成為抗腫瘤化合物研究的候選化合物。但本研究沒有確切找到L20的上游靶點，也沒有在動物體內進行體內實驗，因此下一步打算更深入的挖掘其上游靶點及進行體內實驗，在化學方面也希望能以此化合物為基礎衍生出活性更好的化合物。本研究雖然存在一定的局限性，但第一次發現了CalothrixinB衍生物L20 在CML K562細胞中的作用及機制，為臨床上研究新藥物提供了新方向。