心血管發育相關基因mpx在斑馬魚早期胚胎發育中的表達*

向文碧， 周棟珍， 李志操， 周艷華， 張鵬， 崔冬冰， 何志旭， 舒莉萍**

(1.貴州醫科大學 細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室， 組織工程與干細胞實驗中心, 貴州 貴陽 550004； 2.中國醫學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學 兒科學教研室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州大學， 貴州 貴陽 550025； 5.貴州省貴陽市婦幼保健院 貴陽市兒童醫院， 貴州 貴陽 550003； 6.遵義醫科大學附屬醫院 兒科學教研室， 貴州 遵義 563000)

髓過氧化物酶(myeloperoxidase， MPO) 是髓系細胞的特異性標志物，主要由中性粒細胞以及單核細胞分泌[1-2]。隨著對MPO的深入研究，發現MPO涉及多種疾病進程。既往國內外研究證實，MPO與心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發生有關[3-4]，髓樣特異性過氧化物酶mpx基因是斑馬魚中最接近哺乳動物MPO基因的同源物[5]?；诎唏R魚胚胎通體透明、體外受精、發育迅速等優勢，本研究以斑馬魚為實驗動物開展相關實驗研究，旨在探討斑馬魚mpx在胚胎發育過程中的表達，為進一步探索mpx與CVD的關系及開發治療CVD的新藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 野生型斑馬魚由本課題組實驗中心飼養：28 ℃循環水中養殖，幼魚和成魚分別以草履蟲和豐年蝦喂養，光照12 h/d，收集受精后0.75 h、3.7 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、72 h(hours post-fertilization, hpf)共11個時相的胚胎，用于提取總RNA和原位雜交。

1.1.2主要實驗試劑 限制性內切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、DNA Marker、Trizol、First Strand cDNA Synthesis Kit試劑均購自Thermo公司，KOD-Plus PCR酶購自Toyobo公司，T3聚合酶購自Promega公司，T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，地高辛RNA和NucAwayTMSpin Columns均購自Ambion公司，BCIP/NBT試劑盒購自VECTORLab公司，Proteinase K購自Sigma公司，酵母提取物和氨卞青霉素均購自素索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1斑馬魚總RNA提取及cDNA的合成 收集0.75 h、3.7 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、72 hpf共11個時相的斑馬魚胚胎，每個時相25枚置于1.5 mL的Ep管中，按Trizol法提取總RNA，然后用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按說明書將RNA逆轉錄成 cDNA后于-20 ℃保存備用。

1.2.2mpx基因片段克隆 用NCBI查詢mpx基因的全長cDNA，根據mpx全長cDNA設計mpx基因引物序列，mpx-R:5′-CCCAAGCTTCCTCAACGACAGCACTCTGA-3′，mpx-F: 5′-TCGCTCGAGTACTC

CAGGTAGGGTTGAGCA-3′，該引物含有Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min，(94 ℃ 15 s、61 ℃ 30 s、68 ℃ 1 min)36次循環，68 ℃ 10 min。將擴增的目的條帶割膠回收。

1.2.3pCS2+-mpx探針質粒構建及鑒定 用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶將PCR擴增的mpx產物和載體pCS2+進行雙酶切，電泳分析雙酶切產物并割膠回收。將酶切后的mpx基因PCR產物和載體pCS2+用T4連接酶進行連接、連接產物進行轉化，通過AMP抗性進行篩選，長菌后挑單克隆用于菌落mpx基因RT-PCR鑒定，并通過試劑盒抽提pCS2+-mpx探針質粒；再將獲得的pCS2+-mpx探針質粒用HindIII和XhoI酶進行雙酶切鑒定，且送諾賽基因公司進行測序鑒定。

1.2.4地高辛標記的mpx基因反義mRNA的制備 用Hind ⅢI將pCS2+-mpx質粒酶切線性化并回收，再以線性化的pCS2+-mpx質粒為模板，加入地高辛標記的寡核苷酸用T3聚合酶合成mpx探針并回收，電泳鑒定后保存在-70 ℃。

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交(whole mount in situ hybridization，WISH) 洗滌和脫水：將不同時相的胚胎從4 ℃冰箱取出并用1×PBST進行洗滌，再用1×PBST配置的不同濃度的甲醇將胚胎進行梯度脫水處理。預雜交：加入1 mL預雜交液于68 ℃預雜交15 min，去掉預雜交液，加入0.3 mL雜交液于68 ℃預雜交1 h。雜交：加入300 ng探針于68 ℃雜交過夜。洗滌：去掉雜交液后用不同濃度SSCT進行洗滌。封閉：用阻滯液封閉2 h。孵抗體：于阻滯液中加入為1 ∶5 000(體積比)地高辛抗體，于冷庫中4 ℃孵育過夜。洗滌：用MABT進行洗滌。染色：用BCIP/NBT染液室溫進行染色約4 h，邊染色邊觀察并記錄。終止染色和拍照：染色完畢后，用1×PBST洗去染液終止染色，并用體視顯微鏡進行拍照。

2 結果

2.1 mpx基因擴增結果

mpx基因擴增結果得到一條單一的位于100～200 bp的電泳條帶，大小跟設計的mpx目的片段173 bp相符(圖1)，說明mpx基因片段擴增成功。

注：M為DNA marker Ⅰ，1為mpx RT-PCR product，2為Blank control。

圖1mpx基因 RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果
Fig.1 Electrophoresis ofmpxgene amplified by RT-PCR

2.2 酶切鑒定結果

pCS2+-mpx雙酶切后得到兩個條帶，一條位于100～200 bp，這與目的片段mpx基因的173 bp大小是一致的；另外一條約4 016 bp，這與pCS2+載體Hind Ⅲ、XhoI雙酶切產物的電泳結果一致(圖2)。說明pCS2+-mpx探針質粒構建成功。

注：M為DNA marker Ⅲ，1為pCS2+，2為pCS2+-mpx，3為mpx PCR product，4為Blank control。

圖2pCS2+-mpx重組質粒HindⅢ、XhoⅠ雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳結果
Fig.2 Electrophoresis of digestion products ofpCS2+-mpxbyHindⅢ andXhoⅠ

2.3 pCS2+-mpx重組質粒菌落RT-PCR鑒定結果

pCS2+-mpx重組質粒經菌落RT-PCR得到的條帶與設計的mpx目的片段一致(圖3)。

注：M為DNA marker Ⅰ，1為mpx RT-PCR product，2為Blank control。

圖3pCS2+-mpx重組質粒菌落RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果
Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR product of bacterial colony for recombinant plasmidpCS2+-mpx

2.4 pCS2+-mpx重組質粒測序結果

通過氨芐抗性篩選的pCS2+-mpx重組質粒經測序結果如圖4，經NCBI檢索對比發現與mpx基因一致。說明pCS2+-mpx探針質粒構建正確。

圖4 pCS2+-mpx重組質粒測序結果Fig.4 Verification of sequence in recombinant plasmid pCS2+-mpx by sequencing

2.5 mpx基因的斑馬魚全胚胎原位雜交結果

結果顯示在18 hpf前的斑馬魚胚胎中無明顯陽性信號表達，在24 hpf，斑馬魚胚胎中間細胞團有較弱的藍紫色陽性信號表達；從24 hpf開始一直持續到72 hpf，在斑馬魚胚胎卵黃囊表面、心臟和軸向脈管系統中出現較強的的藍紫色陽性信號表達；尤其是在72 hpf，在整個胚胎頭部、卵黃囊表面、尾部中均有彌散的藍紫色陽性信號表達(圖5)。說明mpx基因在斑馬魚胚胎18 hpf以后開始表達，并且主要在心血管系統中高表達。

注：紅色箭頭所示心臟，藍色箭頭所示軸向脈管系統，黑色箭頭所示中間細胞團。

圖5mpx基因的斑馬魚全胚原位雜交結果(40×)
Fig.5 Expression pattern ofmpxgene in zebrafish embryos at different periods after fertilization using whole-mount in situ hybridization (40×)

3 討論

MPO是血紅素過氧化物酶超家族的主要成員，主要表達于中性粒細胞、單核細胞[6]。人MPO是一種同源二聚體蛋白，其質量大小為146 kDa，主要由兩個結構完全相同但功能相互獨立的73 kDa的蛋白質所構成。人類mpo基因位于17號染色體，由12個外顯子和11個內含子構成，大小約11 kb。MPO在血液中水平升高與炎癥和氧化應激增加有關[7-8]，并且國內外研究表明MPO與CVD (包括冠狀動脈疾病、動脈高壓、肺動脈高壓、心肌缺血再灌注相關損傷、中風、心律失常和靜脈血栓形成等)之間存在聯系[9-13]，MPO升高可能意味著CVD的風險增加[14]。斑馬魚相比于其它模式生物具有胚胎通體透明、體外受精、發育迅速等用于VCD研究和開發心血管新藥的優勢[15]，因此本研究以斑馬魚為實驗動物開展相關研究。

mpx基因是斑馬魚中最接近哺乳動物MPO基因的同源物。成年斑馬魚體內主要包括嗜異性粒細胞(即中性粒細胞)和較稀有的嗜酸性粒細胞這兩種粒細胞。mpx基因主要表達在斑馬魚的中性粒細胞，并且斑馬魚中性粒細胞的發生發展及功能活性與哺乳動物中性粒細胞類似[16]。因此，本研究主要探討斑馬魚mpx基因的具體表達模式，以期為進一步探索mpx與CVD的關系和開發治療CVD的新藥奠定基礎。本課題首先通過設計mpx基因引物成功擴增出mpx基因片段，并通過基因重組技術構建pCS2+-mpx重組質粒，經菌落mpx基因RT-PCR、雙酶切和測序鑒定pCS2+-mpx質粒構建成功。然后，以pCS2+-mpx質粒為模板用T3聚合酶成功制備了mpx反義RNA探針。最后，用全胚胎原位雜交技術檢測了斑馬魚mpx在胚胎發育中的具體表達情況。

原位雜交結果顯示，mpx基因在18 hpf前的斑馬魚胚胎中無明顯表達，提示mpx基因在斑馬魚胚胎中18 hpf前可能不表達或者表達量較少以致于用全胚胎原位雜交技術無法檢測出。在24 hpf，mpx基因在斑馬魚胚胎中間細胞團中低表達，這與中性粒細胞產生的位置一致[17]。斑馬魚心血管系統由靜脈竇、心房、心室和動脈球等結構組成，斑馬魚的心血管發育速度較快, 心肌在22 hpf即開始收縮，24 hpf產生心跳，48 hpf心血管系統發育基本完成[18-19]。在22 hpf時，原始心管能夠產生有節奏的蠕動波，在大約33 hpf原始心管心管發育成S形構型并分化成心房和心室時，這些蠕動波轉化為規律協調的收縮[20-21]。本研究發現，mpx基因24～72 hpf在斑馬魚卵黃囊表面及心臟高表達，這與斑馬魚心臟發育的主要部位和時間相吻合，提示mpx基因可能參與調控斑馬魚心臟的發育。血管是所有器官功能和發育的基本組成部分，具有不同的大小和特殊的反應性，這取決于它們的功能和它們所連接的器官[22]。斑馬魚血管發育始于內皮祖細胞從中胚層遷移形成原始主動脈和主要靜脈而形成簡單的循環，在24 hpf后，建立主要的軸向血管[23-24]。到72 hpf時，主要的軸向血管通過背腹對齊的節間動脈和節間靜脈相連，隨后產生兩個單獨的背側縱向吻合血管以連接軀干每側的節間血管[25-26]。本研究發現，從24 hpf開始斑馬魚mpx基因在卵黃囊表面和軸向脈管系統中高表達，一直持續到72 hpf，這與斑馬魚早期胚胎血管發育的時間和部位一致，尤其是在72 hpf，mpx基因在整個斑馬魚胚胎頭部、卵黃囊表面、尾部中彌散表達，這與血管是所有器官和組織的基本組成部分的特點相吻合，提示mpx基因可能與斑馬魚血管的發育相關。

綜上所述，本研究通過構建pCS2+-mpx質粒制備mpx反義RNA探針，并以mpx反義RNA探針進行全胚胎原位雜交技術證實，mpx基因在斑馬魚的心血管系統發育的時間和部位中都有表達，提示mpx基因可能參與調控斑馬魚心血管系統發育，但具體機制有待進一步研究。