何首烏、虎杖、大黃水提物中游離蒽醌含量的測定及對人正常肝細(xì)胞的毒性作用

王呈諭，劉曉璇，李軼群，李登科，孫震曉*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

何首烏(Polygoni Multiflori Radix)、虎杖(Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix)、大黃(Rhei Radix et Rhizoma)為臨床常用中藥[1]，近年來其在臨床及動物試驗中多有致肝損傷報道，如何首烏與制何首烏及二者相關(guān)制劑可引起患者肝損害[2]，臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)含虎杖復(fù)方制劑可致肝功能異常[3]，動物實(shí)驗表明大黃可致老年大鼠肝細(xì)胞壞死及輕度膽道增生[4]。前期研究表明，何首烏和大黃的肝毒性可能與其含有的游離蒽醌(如大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚等)有關(guān)[5-6]。3種中藥均含游離蒽醌，雖然所含游離蒽醌種類及含量不同，但游離蒽醌在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化[7]，因而比較3種藥材游離蒽醌含量與其肝細(xì)胞毒性的關(guān)系可為闡明3種中藥可能的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制提供思路。

游離蒽醌含量測定常采用高效液相色譜色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]。HepaRG細(xì)胞為人正常肝祖細(xì)胞，分離于慢性丙肝患者肝組織，可在體外長期繼代培養(yǎng)，一定條件下能分化為明顯的肝細(xì)胞形態(tài)和膽管樣結(jié)構(gòu)，能表達(dá)正常肝細(xì)胞相關(guān)的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶，如CYP450及UGT1A1等，是體外研究藥物肝毒性的良好工具[9-11]。本研究主要通過比較3種中藥水提物中游離蒽醌含量及其對人正常肝細(xì)胞的毒性作用探究游離蒽醌與3種中藥肝細(xì)胞毒性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

實(shí)驗用何首烏(產(chǎn)地湖北，批號01106600)、大黃(產(chǎn)地甘肅，批號401004095)、虎杖(產(chǎn)地浙江，批號401004461)飲片均購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定，均為正品。大黃素(批號wkq16071004)、大黃素甲醚(批號wkq16070403)、蘆薈大黃素(批號140827)、大黃酸(批號140526)、大黃酚(批號140219)均購買于四川省維科奇生物科技有限公司(各成分HPLC檢驗含量均≥98%)。甲醇(色譜純)購自Fisher公司，液相用水來源于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Visual Technologies Inc，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自北京拜爾迪生物科技有限公司，甲醇(分析純)、磷酸、無水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、NaHCO3、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4等均購自北京化工廠，噻唑蘭(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，購于Waters公司；ME204E/02分析天平，購于梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；EPOCH酶標(biāo)儀，購于美國伯騰儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；A00-1-1102流式細(xì)胞儀，購于貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 細(xì)胞株

HepaRG人肝祖細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.4 中藥水提物的制備

稱量3種受試飲片，加入圓底燒瓶中。第1次取10倍量超純水，煎煮2 h，藥液過濾留存；第2次取8倍量超純水，煎煮1.5 h，藥液濾出后與第1次留存藥液合并。

使用大容量旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和恒溫水浴去除多余水分。放至室溫，-20℃預(yù)凍1 d，-80℃預(yù)凍1 d，置于真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥后，研磨成細(xì)粉，避光干燥保存。

1.5 溶液配制

1.5.1 HPLC供試品溶液制備 分別稱取上述何首烏水提物粉末0.203 9 g，虎杖水提物粉末0.203 1 g，大黃水提物粉末0.204 6 g，各加甲醇25 mL后稱重，超聲溶解40 min后，用甲醇補(bǔ)充至原始質(zhì)量，以0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 稱取各標(biāo)準(zhǔn)品(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)，加甲醇溶解定容，分別得到濃度為360、213、404、418、456μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 mL置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以0.45μm濾膜過濾，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.5.3 細(xì)胞實(shí)驗藥液制備 稱取1.4中得到的受試飲片水提物粉末，加RPMI 1640完全培養(yǎng)基超聲溶解1 h，得濃度為6 mg/mL的水提物母液(水提物溶液濃度均以生藥計)，經(jīng)0.45μm濾器過濾，再經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾后備用。細(xì)胞給藥時，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基梯度稀釋水提物母液，得到濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL(均以生藥計)的水提物藥液，備用。

1.6 中藥水提物中游離蒽醌含量測定

本研究采用HPLC法對3種中藥水提物中的各游離蒽醌進(jìn)行含量檢測。

1.6.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL AK-C18(250×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇(A)，0.1%磷酸水溶液(B)；檢測器：UV檢測器；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：室溫。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 線性關(guān)系考察 按梯度體積，各吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液5次于容量瓶中，各自加甲醇定容，搖勻，0.45μm濾膜過濾，備用。進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 精密度 吸取供試品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算各成分峰面積平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值。

1.6.4 穩(wěn)定性 吸取供試品溶液，室溫放置，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10μL，測定各成分峰面積，計算峰面積平均值及RSD值。

1.6.5 重復(fù)性 取同一批水提物粉末6份，按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液，測定各成分含量，計算各成分含量平均值及RSD值。

1.6.6 加樣回收率考察 稱取已知各成分含量的各藥材水提物6份，每份約0.1 g，分別添加各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液。測定各成分峰面積，計算各成分含量和各成分的加樣回收率及RSD值。

1.6.7 游離蒽醌含量測定 按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液，單次進(jìn)樣10μL，測定各游離蒽醌峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法計算各游離蒽醌的含量。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

HepaRG細(xì)胞在含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.8 MTT法測定細(xì)胞活力

選取處于對數(shù)生長期的HepaRG細(xì)胞，使用0.25%的胰酶消化成單個細(xì)胞，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個/mL。將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液去除，加入培養(yǎng)基或不同濃度的各種中藥水提物溶液(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)，每組平行4孔，每孔150 μL(預(yù)實(shí)驗測定各組pH值、滲透壓均在正常范圍以內(nèi))，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄去藥液，加入MTT工作液(0.5 mg/mL)，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去孵育液，每孔加入DMSO 150μL，溶解結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下檢測吸光度D(570)，計算細(xì)胞存活率。

1.9 AnnexinⅤ/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡

選取處于對數(shù)生長期的HepaRG細(xì)胞，使用0.25%無EDTA的胰酶消化成單個細(xì)胞，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為8×104個/mL。將細(xì)胞接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液去除，加入培養(yǎng)基或不同濃度的各種中藥水提物溶液(1.5、2.0、2.5mg/mL)，每組平行3孔，每孔3 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集全細(xì)胞至離心管，2 000 r/min，離心2 min；用PBS洗滌細(xì)胞兩次(2 000 r/min，離心2 min)；按照試劑盒說明書加入結(jié)合緩沖液500μL，重懸細(xì)胞；加入5μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙錠混勻；室溫條件下，避光孵育5～15 min；1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。在儀器上，參考對照組散點(diǎn)圖，可將實(shí)驗組分為正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并分別顯示各類細(xì)胞所占細(xì)胞總量的百分比。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行回歸分析，以表示。在細(xì)胞活力與凋亡程度方面，對照組和實(shí)驗組間樣本差異的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 線性關(guān)系測定結(jié)果

2.1.2 精密度考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.67%和1.32%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.73%和2.95%；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.29%、1.72%、2.36%、1.54%和0.66%。所有RSD值均小于3.0%(n=5)，表明方法的精密度良好，符合實(shí)驗要求。

2.1.3 穩(wěn)定性考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.98%和2.53%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.20%和0.97%；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.96%、1.10%、2.73%、2.87%和2.68%。所得的所有RSD值均小于3.0%(n=5)，表明供試品溶液在室溫放置24 h之內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.81%和1.29%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.88%和1.92%，；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.31%、1.42%、2.91%、2.71%和1.67%。所得RSD值均小于3.0%(n=5)，表明該方法的重復(fù)性良好，3種藥材水提物中各成分測定含量穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率考察 按上述進(jìn)行加樣回收率的考察，結(jié)果見表3，3種藥材水提物中各游離蒽醌加樣回收率均處于95%～105%之間，RSD值均小于3.0%(n=5)，表明該方法的回收率良好。

表3 3種中藥水提物加樣回收率考察結(jié)果

2.2 何首烏、虎杖、大黃游離蒽醌含量測定

3種中藥水提物及生藥中游離蒽醌含量見表4，何首烏為0.229%，虎杖為0.545%，大黃為2.593%，各中藥水提物中5種主要游離蒽醌總含量順序：何首烏＜虎杖＜大黃。

2.3 中藥飲片水提物對體外培養(yǎng)HepaRG細(xì)胞活力的影響

3種中藥水提物對HepaRG細(xì)胞存活率的影響見圖1，何首烏在2.0、2.5、3.0 mg/mL濃度下表現(xiàn)出明顯的抑制細(xì)胞活力的作用；虎杖在1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL濃度下表現(xiàn)出顯著的抑制作用；大黃在所設(shè)全部濃度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL下均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，3種中藥水提物對人正常肝細(xì)胞的抑制作用均成劑量依賴性，抑制作用順序為何首烏＜虎杖＜大黃。除何首烏IC50值為3.17 mg/mL，在所設(shè)濃度范圍之外，虎杖和大黃的均在所設(shè)濃度范圍之內(nèi)，分別為2.23、1.91 mg/mL。

表4 3種中藥水提物中游離蒽醌的含量

何首烏水提物各劑量組與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；虎杖水提物各劑量組與對照組比較，&&P＜0.01；大黃水提物各劑量組與對照組比較，##P＜0.01.圖1 何首烏、虎杖、大黃水提物作用HepaRG細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活率

2.4 中藥飲片水提物對體外培養(yǎng)HepaRG細(xì)胞凋亡的影響

3種中藥飲片水提物對HepaRG細(xì)胞凋亡的影響見表5，在1.5、2.0、2.5 mg/mL濃度下，何首烏水提物誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞總凋亡率分別為(2.52±0.95)%、(7.23±0.12)%、(23.36±1.91)%，虎杖水提物分別為(15.47±2.49)%、(52.91±0.37)%、(74.4±0.76)%，大黃水提物分別為(56.24±3.08)%、(82.36±0.53)%、(85.67±0.31)%，與對照組總凋亡率(0.04+0.01)%相比，3種中藥水提物均明顯誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞凋亡，各濃度下對細(xì)胞凋亡的影響大小順序為何首烏＜虎杖＜大黃。

表5 何首烏、虎杖、大黃對HepaRG細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

本研究采用HPLC法測定了3種中藥何首烏、虎杖、大黃主要游離蒽醌大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚含量，比較了3種中藥水提物中游離蒽醌的含量，發(fā)現(xiàn)大黃中的游離蒽醌以大黃酚和大黃酸較高，其次為大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素，而虎杖和何首烏則僅檢測出大黃素和大黃素甲醚，整體來看，游離蒽醌的含量排序為何首烏＜虎杖＜大黃。本研究選用人正常肝祖母細(xì)胞HepaRG比較研究了3種中藥水提物體外肝細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力及凋亡實(shí)驗均表明，3種中藥提取物的肝細(xì)胞毒性為何首烏＜虎杖＜大黃，與游離蒽醌含量順序一致，提示3種中藥游離蒽醌含量與其肝細(xì)胞毒性有一定相關(guān)性。

已有多個課題組報道過游離蒽醌對肝細(xì)胞的毒性作用。如我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以誘導(dǎo)人肝實(shí)質(zhì)L02細(xì)胞凋亡[5]。竇志華等用大黃游離蒽醌提取物灌胃大鼠獲得含藥血清(含5種原型成分、15種代謝產(chǎn)物)，并以不同劑量含藥血清處理HL-7702細(xì)胞，檢測其谷草轉(zhuǎn)氨酶的泄漏情況，發(fā)現(xiàn)大黃蒽醌類成分具有肝毒性，且游離蒽醌為效應(yīng)物質(zhì)之一[6]。賈歌劉暢的細(xì)胞實(shí)驗表明何首烏醇提物以及大黃素、大黃酸等對人正常肝細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)凋亡作用，且大黃素的作用要強(qiáng)于大黃酸[12]。劉德明等使用大黃素作用于L02細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)一定濃度的大黃素對L02細(xì)胞具有明顯的毒性，能夠顯著提升L02細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，激活caspase-8[13]。衛(wèi)培峰等對大鼠連續(xù)3個月經(jīng)口灌胃大黃素、大黃酸和大黃酚，發(fā)現(xiàn)大黃素、大黃酸并不能促進(jìn)大鼠體內(nèi)肝細(xì)胞凋亡，但大黃酚可以導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞凋亡[14]。任璐等對大鼠連續(xù)14 d經(jīng)口灌胃給藥大黃素甲醚，未見明顯的與大黃素甲醚有關(guān)的肝毒性[15]。上述研究表明，游離蒽醌有肝細(xì)胞毒性，但是各個單體的貢獻(xiàn)及在體內(nèi)的實(shí)際作用還需要進(jìn)一步研究闡明。汪美汐等使用大黃素處理L02細(xì)胞，通過測定細(xì)胞活力、細(xì)胞損傷和CYP450 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)大黃素對人正常肝細(xì)胞有一定的損傷作用，推測大黃素可以通過誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA的表達(dá)促進(jìn)相應(yīng)底物活化，誘發(fā)肝毒性或通過誘導(dǎo)CYP7A1 mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致膽汁淤積型肝損傷[16]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，何首烏水提物及游離蒽醌均可抑制大部分大鼠肝藥酶的表達(dá)[17-18]，同時發(fā)現(xiàn)何首烏肝毒性與大鼠肝臟CYP1A2或CYP2E1的低活性相關(guān)[19]，敲除人肝細(xì)胞中某些肝藥酶可顯著增加大黃素等游離蒽醌的肝細(xì)胞毒性[20]，推測臨床上何首烏特異質(zhì)肝毒性可能與人群中基因多態(tài)性造成的肝藥酶低表達(dá)與何首烏中游離蒽醌所致肝藥酶活性降低雙重作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，何首烏、虎杖、大黃水提物的肝細(xì)胞毒性與其游離蒽醌含量成正相關(guān)，提示研究這3種中藥肝毒性需重點(diǎn)關(guān)注藥材中游離蒽醌含量及游離蒽醌體內(nèi)代謝情況，如藥物代謝酶基因表達(dá)及活性等，為臨床上3種中藥的安全、精準(zhǔn)使用提供參考。