一個家族性高膽固醇血癥家系的基因突變篩查與評估

張佳虹，張慶英，*，張燕虹，陳甲連，謝 芳，劉銳國，吳 容，吳龍飛

(1．汕頭大學醫學院公共衛生與預防醫學教研室，廣東 汕頭 515041；2．云南省玉溪市紅塔區疾病預防控制中心慢性病防治科，云南 玉溪653100)

家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，FH)是一種常見的常染色體遺傳性代謝疾病，其特征是血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的顯著升高，甚至有早發的動脈粥樣硬化性疾病和心血管疾病[1]。FH的患病率約為1/250，全世界估計有1 400萬～3 400萬名患者[2]。中國僅有的人群流行病學調查來自江蘇省9 324人的營養研究，數據顯示FH患病率為0.28%(標化率為0.18%)[3]。FH的心血管疾病患病風險較高，有研究表明，與無突變且血脂正常的人相比，無突變但LDL-C高于4.9 mmol/L的人患心血管疾病的風險是前者的6倍，而攜帶FH致病突變且血脂異常的人患心血管疾病的風險則高達22.3倍[4]。DO等對早發性心肌梗死患者的研究顯示，約2%患者攜帶FH的基因致病性突變[5]。盡管FH對心血管系統的危害較大，但全世界FH的診斷率和治療率仍較低，大多數國家的診斷率不足1%[2，6]。目前我國關于FH的研究仍然較少，其診斷主要依據臨床表現，對于相應的遺傳變異情況不明，尚需結合基因檢測。近年來，隨著分子生物學技術的發展，全基因組測序應用于臨床輔助診斷有望實現[7-8]。FH的早期篩查和診斷有助于患者的早期治療，降低心血管疾病患病風險和預防早死，改善預后和促進康復。故本研究以一個臨床診斷的FH家系為調查對象，結合家系成員的臨床指標和基因篩查結果，重點對LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1這4個公認的與FH相關的基因進行篩查，并進行生物信息學的SNP功能預測，以尋找該家系的致病基因，為其維持合適的血脂水平和促進健康提供指導作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象來源于云南省玉溪市某社區流行病學項目篩查發現的血脂異常的高膽固醇血癥患者，選取其中1名總膽固醇(total cholesterol，TC)達8.71 mmol/L的患者為研究對象，進一步篩查其家庭成員的血脂情況。根據《中國成人血脂異常防治指南》[9]，美國國家脂質協會血脂異常治療指南建議[10]、陳在嘉主編的《臨床冠心病學》[11]綜合考量，制定FH診斷標準[12]：接受調脂藥物治療的患者血清TC水平≥6.22 mmol/L，未接受調脂藥物治療的患者血清TC水平≥7.8 mmol/L，同時至少具有下列特征之一：①患者本人或其直系親屬中有肌腱黃色瘤者；②患者直系親屬中有高膽固醇血癥者；③患者家庭成員中有兒童期就被檢出有高膽固醇血癥者。

根據篩查結果，發現該家系有2名成員符合FH診斷標準，因此將所有家庭成員同時納入進行進一步的基因檢測，并繪制家系圖，Ⅰ表示第一代人，Ⅱ表示第二代人，每一代成員序號則從左往右由1開始依次編號。

1.2 血樣采集

在取得調查對象知情同意后，受試者禁食后于清晨空腹采集外周靜脈血，送玉溪市第三人民醫院檢驗科采用全自動生化儀檢測總膽固醇、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)4項生化指標。

1.3 全基因組外顯子測序

將采集的血液送華大基因，提取白細胞DNA進行全基因組外顯子測序。測序結果應用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)進行序列比對，SOAPsnp，SAMtools或GATK軟件進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點檢測。AnnoDB用于注釋SNP。質量控制貫穿整個數據處理的過程。

1.4 數據分析

本研究重點對4個公認的FH致病基因LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1進行生物信息學分析，采用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(https://sift.bii.a-star.edu.sg/)這兩個常用的具有代表性的數據庫對各個位點進行功能和保守性危害預測。PolyPhen-2考慮了蛋白質結構和比較進化，通過機器學習來預測氨基酸替換對人類蛋白質穩定性和功能的可能影響[13]，并作定性評價：得分0.909～1.000為很可能致病，0.447～0.908為可能致病，0～0.446為良性。SIFT則基于氨基酸保守程度，通過與近似的序列進行比對，計算堿基發生替換的概率，對引起氨基酸改變的非同義的SNP進行功能預測，得分≤0.05提示有害，＞0.05提示可容忍。

2 結果

2.1 血脂情況和家系情況

據調查，該家系4名成員均未發現肌腱黃色瘤，均未服用調脂藥物。家系圖和成員編號見圖1。成員Ⅰ-1的血清TC達8.71 mmol/L，其兒子為高膽固醇血癥者，故Ⅰ-1符合FH診斷標準。成員Ⅱ-1的血清TC達8.05 mmol/L，其母親為高膽固醇血癥者，故Ⅱ-1也符合FH診斷標準。該家系有Ⅰ-1和Ⅱ-1這2名成員患FH，具體情況見表1。

圖1 FH家系圖

表1 FH家系成員血脂情況

2.2 測序結果和危害分析

該家系中共發現了10個SNP位點，分別位于APOB，PCSK9和LDLRAP1基因上，位點情況詳見表2。經Polyphen-2軟件預測，APOB基因上2個SNP位點rs676210和rs679899得分分別為0.999和0.998，均提示很可能致病；2個新位點c.10094A＞T和c.9937C＞G得分分別為0.829和0.770，均提示可能致病。上述4個位點經SIFT軟件預測均為有害的。APOB基因的其他位點、PCSK9和LDLRAP1基因上的位點均被預測為良性。未發現LDLR基因的SNP位點。

該家系中2名患者和2名未患病者均攜帶rs676210和rs679899位點，另有未患病者Ⅰ-2攜帶兩個新位點c.10094A＞T和c.9937C＞G，說明這些位點均不與疾病表型共分離。

表2 家族性高膽固醇血癥家系的APOB、PCSK9、LDLRAP1基因SNP位點情況

3 討論

本研究通過社區發現了一個FH家系，重點對LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1基因進行篩查后發現了APOB基因上4個可能與血脂增高有關的SNP位點，其中rs676210和rs679899為前人報道過的與血脂相關的位點，c.10094A＞T和c.9937C＞G為本研究發現的新位點，但在該家系中這些SNP位點均不與疾病表型共分離，這些位點的功能還有待進一步探討。

FH的分子遺傳機制復雜，目前至少已發現9個致病基因上千個致病位點，包括LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1、APOE、STAP1、LIPA、ABCG5和ABCG8基因[7]。遺傳圖譜和下一代測序結果表明在雜合子FH患者中，80%～85%存在LDLR基因變異，5%～10%存在APOB基因變異，PCSK9和LDLRAP1貢獻的比例均不到1%[7]。目前，國內FH診斷的金標準是檢測到LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1基因的致病性突變[14]，但也有許多患者達到了臨床診斷的標準，但卻未發現致病突變[15-16]。因此專家建議更準確的FH診斷需結合臨床診斷和基因檢測結果[14]。而臨床診斷和基因診斷不一致的患者心血管疾病的風險依舊相當高，仍然需要我們持續關注。

APOB基因位于人2號染色體的短臂上(2p24.1)，有29個外顯子。APOB是乳糜微粒、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和脂蛋白a的載體蛋白，主要以兩種亞型存在：小腸合成的ApoB48和肝臟合成的ApoB100[17]。每個LDL顆粒上都有一個ApoB100分子，用于結合LDL受體，在LDLR的介導下發生內吞作用，進入肝臟代謝，從而清除血液中的LDL-C。APOB基因在脂質的轉運和分解過程中發揮著重要的作用，而該基因突變引起血清APOB升高，可能會導致LDL-C升高和其他脂代謝紊亂、及在正常的LDL-C水平下使冠心病風險增加[7]。

此前Gu等對631名中國裕固族居民的研究顯示，與TT突變基因型相比，APOB基因SNP位點rs676210的CT和CT+CC基因型居民患高血脂的風險分別是1.72倍和1.67倍，攜帶C等位基因的人可能更易患高脂血癥，該位點可能成為裕固族中老年人群高脂血癥篩查的新位點；而在該人群中rs679899不同基因型對血脂的影響未見差別[18]。WOJCZYNSKI等對958人采用非諾貝特治療后發現，rs676210 CC、CT和TT基因型的TG水平分別降低了24.7%、28.3%和34.5%，該位點可能有助于識別對非諾貝特降脂治療敏感的患者[19]。另一項采用遺傳易感性評分的病例對照研究顯示，冠心病患者rs679899各基因型分布有差異，且T等位基因出現的頻率比對照組高[20]。BENN等對哥本哈根心臟隊列研究9185人基因分型結果顯示，與野生基因型相比，rs676210和rs679899位點雜合基因型的血漿LDL-C分別降低了0.14和0.12 mmol/L，rs679899位點純合突變型的LDL-C降低了0.18 mmol/L[21]。rs676210所在的區域參與VLDL轉化為LDL過程中ApoB的結構變化過程[22]，而rs679899則位于調控新生ApoB脂質化的關鍵區 域[23]，二者在ApoB的形成和生物學功能發揮過程中都起著重要作用，值得我們進一步地探究。而兩個新位點c.10094A＞T和c.9937C＞G是否在血脂代謝過程中發揮生物學作用，還需進一步的人群研究和功能實驗來佐證。

本研究未發現PCSK9和LDLRAP1基因上的有害變異。PCSK9和LDLRAP1基因突變通常與家族性高膽固醇血癥有關。研究表明PCSK9通過誘導LDL受體(LDLR)的降解來參與脂質代謝，使血液中LDL-C水平升高[24]。PCSK9功能獲得型突變通常引起膽固醇升高，臨床上PCSK9抑制劑多與他汀類聯合用藥來控制血脂[25]。LDLRAP1基因編碼的蛋白通常與LDLR蛋白結合，參與LDL的內化、LDLR的循環利用或降解過程[7]。

目前，FH有1 097個致病或可能致病位點，但85%的位點體外功能研究證據缺乏[26]，新位點的發現和功能研究是闡明潛在的生物學機制和藥物作用靶點的關鍵，對FH患者的篩查識別和預后也至關重要[26-27]。因此，建議有條件的疑似或臨床診斷FH患者進行基因檢測，做到早發現早治療。本研究也存在一定的局限性，如僅針對一個家系進行研究，未檢測血液APOB水平，未進行功能驗證實驗等，后續還需繼續擴大樣本量，增加檢測指標，從多方面驗證SNP與疾病的關系。