牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、 pVAX1-HA2/IL-15鼻腔黏膜免疫SD大鼠的實驗研究

白國輝 曾鳳嬌 楊琳 陳靖 劉建國 田源

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)，一種革蘭氏陰性厭氧球菌，與慢性牙周炎的發生密切相關。P.gingivalis通過其細胞表面的HA2基因與血紅蛋白中血紅素的卟啉環結合去獲得其生存所必需的鐵和卟啉, 同時P.gingivalis生存的厭氧環境也需要菌體表面的血紅素維持[1]。張荃等[2]認為HA2基因是P.gingivalis引起牙周炎的相關因子之一，在DNA和RNA水平上證實了HA2基因與牙周狀態有著緊密聯系。白細胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，通過誘導B1細胞的增殖分化，使其分化出分泌SIgA的漿細胞，達到抵御細菌對黏膜粘附從而防御病原入侵的作用。本課題組前期以HA2基因作為目的基因，IL-15作為免疫佐劑成功制備了牙周炎基因疫苗 pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15。并通過RT-PCR在脂質體轉染的真核細胞293T中證實，目的基因HA2在mRNA水平能夠被正確表達。以及制備了相應的蛋白抗原，應用PCR、Western Blot、ELISA等技術證實目的基因在體外能夠被正確表達。本次實驗在前期基礎上，通過牙周炎基因疫苗經鼻腔黏膜免疫SD大鼠后，檢測唾液中相關的特異性抗體水平變化，觀察該基因疫苗的免疫原性，探索牙周炎基因疫苗防治牙周病的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

SD大鼠(第三軍醫大學野戰外科研究所動物室，質檢單位：重慶市實驗動物質檢中心，許可證號：SCXK (渝)2012-0005)。牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15、 空載體pVAX1、 HA2抗原為課題組前期構建和保存； Goat anti-Mouse IgA Cross-Adsorbed( Thermo,美國)； 牛血清白蛋白(BSA)、 Secondary Antibody、 HRP(Amresco公司，美國)。戊巴比妥鈉(上海哈靈生物科技有限公司)； 2%硝酸毛果蕓香堿(山東正大福瑞達制藥有限公司)。

1.2 主要試劑配制

Elisa相關試劑配置詳見參考文獻[3]。

1.3 實驗動物分組與免疫

32只7周齡雌性SD大鼠隨機分為4 組，每組8 只。實驗組：A、B組，對照組：C、D組。具體如下：A組：pVAX1-HA2組；B組：pVAX1-HA2/IL-15組；C組：pVAX1組；D組：生理鹽水組。免疫3 次，在第0 天、 7 天、 14 天對大鼠進行雙側鼻腔黏膜免疫，免疫劑量為200 μg/次/(1 μg/1 μl)。

1.4 樣本采集

采集實驗動物唾液樣本，免疫前1天及免疫后每周，連續收集9 周。采集方式為腹腔注射2%硝酸毛果蕓香堿(0.3 ml/100 g)，約1 min后收集唾液量約0.5 ml。 4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，-80 ℃保存備用。

1.5 間接ELISA法檢測唾液中sIgA抗體水平

以交叉連續稀釋分析法確定出酶標抗體過氧化酶標記羊抗大鼠IgA最佳工作濃度為: 1∶4 000, HA2、FimA抗原最佳包被濃度為2.5 μg/ml；唾液樣本最佳稀釋濃度1∶4。按濃度梯度包被96 孔酶標板，5% BSA封閉，每孔加入100 μl唾液樣本(PBST 1∶4稀釋)。 37 ℃濕盒溫育2 h，加入HRP標記的羊抗大鼠IgA抗體(1∶4 000),底物顯色，酶標儀檢測A450值。

1.6 免疫部位目的蛋白的表達的檢測

免疫后第5 周每小組取2 只大鼠處死，分離鼻腔黏膜，固定、包埋、 5 μm 連續切片,免疫組織化學檢測。先進行抗原修復(HA2：0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液加熱10 min 30 s)所用抗體如下：一抗為根據預實驗確定HA2：1∶200; 陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃過夜；二抗37 ℃孵育20 min。DAB顯色，常規透明、脫水和封片。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 唾液中特異性抗體檢測

免疫后第1 周抗體水平開始上升，2～5 周逐步上升，于第5 周達到高峰，第9 周抗體基本降低到免疫前水平。牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15經鼻黏膜免疫產生的唾液SIgA型抗體水平明顯高于空載組和生理鹽水組。pVAX1-HA2/IL-15組誘導抗體水平除第2 周外均高于pVAX1-HA2組； pVAX1-HA2組于第8 周抗體水平已趨近于免疫前水平，而pVAX1-HA2/IL-15組在第9 周表現出此現象，說明IL-15佐劑的使用可能有助于維持抗體高水平的持續時間(圖 1，表 1)。

圖 1 大鼠唾液中SIgA型抗HA2 抗體水平趨勢圖

表 1 各組SD大鼠唾液中SIgA型抗HA2抗體A450值組間比較(P值)

2.2 鼻腔黏膜目的蛋白的表達的觀察

HA2蛋白在鼻腔黏膜固有層中黏液性腺泡，腺體及部分巨噬細胞胞質內見棕黃色目的蛋白的表達，對照組沒有出現陽性染色(圖 2)。

A：pVAX1-HA2滴注組; B：pVAX1-HA2/IL-15滴注組; C：pVAX1空載體滴注組

圖 2 HA2蛋白免疫組化定位(×400)

A: pVAX1-HA2 group; B: pVAX1-HA2/IL-15 group; C: pVAX1 blank control group

Fig 2 Immunohistochemical localization of HA2 protein(×400)

2.3 一般安全性檢查

2.3.1 實驗中SD大鼠的體重整體變化呈逐漸上升趨勢，比較相同時間各組中SD大鼠的體重發現差異不具有統計學意義(P>0.05)(圖 3，表 2)。

2.3.2 病理切片檢查 由(圖 4～8)可看出各實驗組及對照組SD大鼠的臟器均未見明顯異常病理學變化。

3 討 論

P.gingivalis的生長和定植都要依靠鐵及卟啉，但其自身缺乏合成卟啉及鐵的能力，而血紅素可以為P.gingivalis提供其生存所需的鐵和卟啉[4-7],因此結合和吸收血紅素成為P.gingivalis保持活性的條件。而P.gingivalis在降解血紅蛋白、攝取血紅素過程中發揮主要作用的結構是血凝集素/黏附結構域[8-10]。在血凝素基因hagA的核心區域的四段序列中，HA2發揮著重要作用，它與血紅蛋白綁定, 溶解紅細胞獲得血紅蛋白的賴氨酸、吸收鐵、血紅素或卟啉[11]，是使P.gingivalis聚集的多功能蛋白區。這提示我們可以通過研制以HA2基因作為目的基因的疫苗去抑制P.g的生長和定植從而預防P.gingivalis誘導的牙周炎。

A：pVAX1-HA2滴注組; B：pVAX1-HA2/IL-15滴注組; C：pVAX1空載體滴注組D：生理鹽水滴注組

圖 3 隨時間變化各實驗組大鼠體重結果

A: pVAX1-HA2 group; B: pVAX1-HA2/IL-15 group; C: pVAX1 blank control group; D: Normal saline control group

Fig 3 The weight levels of SD rats

圖 4 SD大鼠主要臟器病理切片檢查(HE，×200)

Fig 4 Tissue pathological test of main organs of SD rats(HE, ×200)

有效的免疫原對疫苗的效果起主要影響，但選擇合適的免疫途徑也可以有利于提高疫苗的作用。在以往的研究中，Kuboniwa等[12]曾使用pcDNA3-fimA DNA疫苗經唾液腺內注射的途徑免疫小鼠，張鳳秋等[13]使用經頜下腺注射的途徑免疫小鼠。目前，在牙周炎基因疫苗的相關研究中用到的免疫途徑主要有：口服疫苗免疫，黏膜免疫、腺體免疫、肌肉注射、經頜下腺靶向注射疫苗等[14]。與黏膜免疫相比較，口服疫苗使得疫苗暴露于消化道中，容易降解破壞，導致不能產生理想的免疫反應，經頜下腺靶向注射疫苗途徑又不容易被人們接受。而鼻腔黏膜免疫作為一種黏膜免疫途徑,相較于其它免疫途徑，在利用更少量的免疫原的情況下便可以更早更廣泛地誘導產生體液免疫應答和黏膜共同免疫應答，增強了免疫效果。因此本實驗選擇經鼻黏膜免疫SD大鼠的免疫途徑是可行的。

本實驗使用課題組前期構建的牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2、 pVAX1-HA2/IL-15對SD大鼠進行鼻黏膜免疫，誘導其產生SIgA抗體。結果顯示：經檢測，無論是pVAX1-HA2組還是pVAX1-HA2/IL-15組疫苗經鼻黏膜免疫后可誘導機體產生特異性SIgA抗體，抗體水平與對照組及免疫前相比均升高，說明本課題組構建的牙周炎疫苗pVAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15具有一定的免疫原性且經一般安全檢測初步證實該疫苗無毒性。本實驗為牙周炎基因疫苗的候選基因的選擇上提供了新的方向，為進一步研究奠定了基礎。