鈦種植體表面Ca-antimiR138復合物修飾促進間充質干細胞成骨分化的研究

方開秀 侯亞杰 許曉茹 賈森 魏洪波 宋文

鈦種植體表面誘導骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化是其體內(nèi)骨結合建立的生物學基礎[1-2]。種植體表面物理形貌優(yōu)化是最為經(jīng)典的方式，也是目前臨床上廣泛采用的方法，其中利用陽極氧化的方法建立的可控納米管結構是研究的重要分支之一[3-4]。然而另有一部分研究指出，單純的形貌因素缺乏主動的骨誘導特性，利用功能性生物分子進行種植體表面功能化，直接參與MSCs的成骨分化過程，勢必具有更顯著的優(yōu)勢[5]。本研究前期利用RNA干擾(RNA inteference，RNAi)技術對種植體表面功能化進行了系統(tǒng)性探索，發(fā)現(xiàn)在不同的加載方式下，siRNA(靶向CKIP-1)或miRNA(antimiR138)均可誘導種植體表面MSCs的成骨分化[6-7]，這提示利用RNAi技術進行種植體表面生物功能化修飾具有較強的可行性。在RNAi技術的研究中，安全、高效、經(jīng)濟的納米載體是制約其應用的關鍵環(huán)節(jié)。天然或人工合成的非病毒載體可在一定程度上實現(xiàn)高效、安全的細胞轉染，然而存在成本過高、潛在毒性等不足，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)單純應用鈣離子即可在MSCs中實現(xiàn)高效的RNAi過程[7]，這提示應用鈣離子進行種植體表面RNAi功能化修飾具有極佳的應用前景。本研究觀察了鈣離子轉運siRNA的特點，并將Ca-antimiR138復合物吸附于鈦種植體表面，證實了其誘導MSCs成骨分化的能力。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設備

靶向GFP的siRNA(siGFP)、陰性對照siRNA(siNC)、Cy3熒光標記siGFP(siCy3)、antimiR138以及脂質體2000(lipof)(上海吉瑪公司)； 氯化鈣、氫氟酸、PBS、DMSO(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)； Opti-MEM、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，California，USA)；MTT、4%多聚甲醛、BCIP/NBT染色液(北京雷根生物)； 純鈦試樣(1 cm邊長正方形，西安西北有色金屬研究院)； 倒置熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，日本)； 流式細胞儀(Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA)；酶標儀(FLUOstar，Ortenberg，Germany)；掃描電鏡(S-4800 HITACHI，Tokyo，Japan)；激光共聚焦(Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)；體式顯微鏡(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)。

1.2 細胞培養(yǎng)

端粒酶缺失永生化、穩(wěn)定表達GFP的MSCs細胞由丹麥奧胡斯大學納米中心贈送，細胞培養(yǎng)在常規(guī)培養(yǎng)基中，即在EMEM中加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素。細胞密度達80%左右時進行胰酶消化傳代，細胞按照2×104/cm2密度進行接種。

1.3 細胞常規(guī)轉染過程

細胞培養(yǎng)24 h后在其中額外加入氯化鈣溶液，依據(jù)文獻報道[8]，使得鈣離子濃度區(qū)間為0～50 mmol/L，再分別加入不同的siRNA，使得siRNA終濃度為40 nmol/L，同時采用標準的脂質體2000作為陽性對照、未處理細胞作為陰性對照；轉染6 h后將培養(yǎng)液換成常規(guī)培養(yǎng)基，完成細胞轉染。

1.4 流式細胞儀檢測

在設定檢測點，采用胰酶將細胞消化收集，離心后用PBS清洗，離心、棄上清；采用適量PBS重懸細胞沉淀，進行流式細胞儀檢測，分析10 000 個細胞，利用細胞折光性進行圈門，在FL1通道上分析GFP熒光分布狀況，在FL2通道上分析Cy3熒光分布狀況，同時進行平均熒光強度的定量分析。

1.5 熒光顯微鏡觀察

在設定檢測點，吸棄細胞培養(yǎng)液，加入預熱的PBS，立即在倒置熒光顯微鏡下觀察，曝光時間設定為100 ms并保持一致，每組隨機采集5 張照片。

1.6 細胞活力檢測

細胞轉染72 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS漂洗，加入MTT工作液，37 ℃孵育4 h；將上清輕輕吸棄，加入DMSO充分溶解紫色結晶，于580 nm出讀取吸光度。

1.7 鈦種植體表面修飾

采用20 V電壓下陽極氧化30 min在鈦種植體表面制備親水納米管表面，浸泡在Ca-siRNA復合物中6 h后室溫干燥，采用掃描電鏡和激光共聚焦進行種植體表面觀察。

1.8 ALP染色及圖像分析

采用Ca-antimiR138進行種植體表面修飾，將MSCs培養(yǎng)在種植體表面并誘導成骨分化7 d后，MSCs在種植體表面誘導分化7 d后，采用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS充分清洗后加入BCIP/NBT染色工作液，覆蓋鈦試樣，室溫避光； 30 min后吸棄染色液，加入去離子水終止反應，體式顯微鏡拍照；采用ImageJ軟件對圖像藍紫色深淺進行半定量分析。

2 結 果

2.1 不同鈣離子濃度下siRNA的沉默效率及對細胞活力的影響

可見當鈣離子濃度超過5 mmol/L之后，siGFP處理組細胞GFP熒光強度顯著下降，siNC處理組無顯著變化，同時脂質體2000作用下GFP熒光強度也減弱(圖 1A)；當超過10 mmol/L之后沉默效率可達90%以上，與脂質體2000效果相當(圖 1B)；各組濃度作用下細胞活力未受到顯著抑制，而脂質體2000則表現(xiàn)出一定的細胞活力抑制作用(圖 1C)?；诖?，后期實驗以20 mmol/L的鈣離子濃度進行。

A：不同濃度鈣離子條件下siRNA轉染48 h后熒光顯微鏡觀察； B：GFP沉默效率定量； C：不同鈣離子作用下細胞活力狀況

圖 1 不同鈣離子濃度下siRNA的沉默效率及對GFP-MSCs細胞活力的影響(×100)

A: The fluorescence microscope images after 48 h siRNA transfection under different calcium concentrations； B: The GFP fluorescence intensity knockdown efficiency quantification； C: Cell viability under different calcium concentrations

Fig 1 The siRNA knockdown efficiency and cell viability under different calcium concentrations in GFP-MSCs(×100)

2.2 細胞攝取siRNA觀察

熒光顯微鏡觀察可見明場下每個細胞內(nèi)均有siCy3的進入，表明細胞攝取率接近100%(圖 2A、 2B)；流式細胞儀檢測可見在Ca-siRNA轉染后，細胞紅色熒光分布幾乎全部右移(圖 2C)，平均熒光強度增強約2 倍(圖 2D)。

2.3 血清在Ca-siRNA轉染中的作用

在無血清培養(yǎng)基中進行轉染，可見細胞在6 h后已經(jīng)發(fā)生破裂，與siCy3的位置分布一致，而在有血清培養(yǎng)基中細胞形態(tài)完整，siCy3與細胞輪廓一致(圖 3A)；轉染48 h后，無血清培養(yǎng)基中細胞破裂死亡，在有血清培養(yǎng)基中細胞表現(xiàn)出GFP沉默效果(圖 3B)。

A：明場細胞照片(×100)； B：同一視野下在Cy3通道觀察(×100)； C：流式細胞儀進行Cy3熒光分布檢測； D：流式細胞儀檢測細胞內(nèi)平均熒光強度

圖 2 在20 mmol/L鈣離子作用下細胞攝取siRNA(Cy3標記)效率觀察

A: Bright field image of cells(×100); B: The Cy3 channel at the identical scope(×100); C: Flow cytometry analysis of Cy3 fluorescence distribution; D: The average intracellular fluorescence intensity measured by flow cytometry

Fig 2 The siRNA (Cy3 labeled) uptake observation under 20 mmol/L calcium treatment

2.4 種植體表面Ca-siRNA加載觀察

經(jīng)過陽極氧化后純鈦表面形成規(guī)則的納米管結構，管徑約100 nm，進行Ca-siRNA吸附后表面呈現(xiàn)大量高密度復合物(圖 4A)；采用siCy3進行加載，激光共聚焦觀察并3D重建，可見紅色熒光分布較為均一(圖 4B)。

2.5 種植體表面修飾后誘導MSCs成骨分化檢測

采用Ca-antimiR138進行種植體表面修飾，MSCs在其表面誘導分化7 d后可見ALP活性顯著增強(圖 5A)，半定量分析可見修飾后種植體表面ALP活性增強可達10 倍以上(圖 5B)。

A：Ca-siRNA分別在無血清和有血清培養(yǎng)基中轉染細胞，6 h后進行攝取觀察； B：48 h后觀察細胞GFP熒光強度的變化

圖 3 血清對Ca-siRNA復合物作用的影響(×100)

A: The fluorescence microscope images of Ca-siRNA transfection in the medium with and without serum for 6 h; B: The GFP fluorescence intensity observation after 48 h

Fig 3 Influence of serum on Ca-siRNA complex(×100)

A：掃描電鏡觀察Ca-siRNA在NTs表面的分布； B：激光共聚焦觀察Ca-siRNA(Cy3)的分布

A: Scanning electron microscope images of the Ca-siRNA complex distribution on NTs surface; B: Confocal laser scanning microscope images of Ca-siRNA (Cy3 labeled) distribution

Fig 4 Surface characterization of the decorated titanium implant

A：誘導分化7 d后ALP染色； B：ALP染色圖的半定量分析相對活性

3 討 論

種植體表面生物修飾自提出后就備受關注，被認為是未來種植體表面設計的重要趨勢之一[8]，不同于生長因子、粘附分子等非特異性作用，RNAi的應用極大程度上解決了靶向骨形成的問題[9-10]，因此siRNA/miRNA功能化的植入材料具有良好的應用前景。然而裸露的siRNA/miRNA依賴于高效的轉運載體，也成為其在材料功能化中應用的瓶頸。因此，大量的研究集中在納米載體的開發(fā)，主要包括以陽離子脂質體為代表的lipoplex復合物以及以陽離子聚合物為代表的polyplex兩大類[11]。這些納米載體的設計、合成較為復雜，成本較高且作用機理難以完全闡明，制約了其應用范圍。

鈣離子作為內(nèi)源性的陽離子，發(fā)揮重要的生理功能，Hori等[12]首先報道了富含鈣離子的培養(yǎng)液中寡核苷酸的作用得到顯著增強；隨后Ruvinov等[13]首次系統(tǒng)性闡明了鈣離子轉運siRNA相關的納米材料學特性；本課題前期的研究首次在MSCs中也觀察到了該現(xiàn)象，證實了鈣離子的特殊效應[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)在一定鈣離子濃度的培養(yǎng)基中，裸露的siRNA對靶基因的沉默效率可顯著提升，與前期的研究結果一致；當鈣離子濃度控制在合適的范圍內(nèi)時，可出色的實現(xiàn)靶基因高效沉默，同時對細胞活力不產(chǎn)生顯著影響，這在一定程度上優(yōu)于商品化的脂質體2000，而鈣離子成本低廉，這為后期的應用提供了可能性。關于鈣離子的作用機制雖有相關報道，但對于血清的關鍵作用缺乏描述。事實上，高濃度鈣離子可對細胞造成嚴重損傷，一方面高濃度鈣離子引起細胞外滲透壓增加，引起細胞損傷[14]；另一方面，帶正電的鈣離子可與帶負電的生物大分子結合，高濃度鈣離子引起生物分子功能障礙[15]。本研究在無血清培養(yǎng)基中可以觀察到大量細胞破裂，且破裂的碎片與siRNA的分布一致，這提示高濃度鈣離子可能與某些細胞成分相結合造成細胞破裂。而當有血清存在時，高濃度鈣離子的損傷則被完全消除，出現(xiàn)了理想的RNAi現(xiàn)象，這一方面證實了血清對高濃度鈣離子的損傷具有保護作用，另一方面可能對siRNA作用的發(fā)揮至關重要。事實上，血清中BSA可與鈣離子結合，緩沖其對細胞造成的滲透壓損傷[16]，可以推測，鈣離子-siRNA-血清蛋白三者可共同形成復合物進入細胞內(nèi)發(fā)揮siRNA功能，這也是許多利用鈣離子作為橋接作用制備聚陰離子-Ca-siRNA納米復合物的基礎[17]。在脂質體2000等許多商品化轉染試劑的使用中，均建議使用無血清或低血清培養(yǎng)基進行轉染，而鈣離子則與之相反，這也為實際的應用提供了便利。

鈦種植體陽極氧化后可形成規(guī)則的納米管結構，本身對MSCs的功能具有調控作用，更為重要的是氧化后的表面呈現(xiàn)超親水特性，為水溶性的Ca-siRNA復合物吸附提供了基礎。掃描電鏡觀察證實Ca-siRNA復合物可成功吸附于NTs表面，呈現(xiàn)相對均勻分布，與前期的研究觀察一致。簡單吸附的方法加載可在短期內(nèi)將Ca-siRNA復合物釋放出來，局部形成足夠的鈣離子濃度，這是siRNA功能的發(fā)揮的前提；采用antimiR138修飾后的種植體表面顯著提升了MSCs的ALP活性，提示其成骨分化得到顯著增強。事實上利用siRNA/miRNA分子促進MSCs的成骨分化研究已有廣泛報道[18]，然而如何選擇合適的分子進行加載尚缺乏特定要求。本研究所采用的細胞為端粒酶缺失永生化的MSCs，antimiR138最早被證實在該細胞的成骨分化中發(fā)揮關鍵作用[19]，本課題前期的研究篩查也證實了這一點[7]，然而后期對于特定細胞以及特定功能的需求狀態(tài)下，具體siRNA/miRNA的選擇尚需要進一步明確。

綜上所述，本研究探明了單純應用鈣離子轉運siRNA的相關特性，即安全、高效、簡便、廉價；應用Ca-antimiR138進行種植體表面修飾后，可顯著提升其骨誘導特性，為種植體表面生物修飾的應用提供了新思路。