柴達木黑果枸杞抗氧化物組分分析

王春雨，張志春，盧九斤，張 瑩，孫豐豪，盛海彥

(1.青海大學 農牧學院，西寧 810016；2.青海省氣象局，西寧 810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)屬茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)的多棘刺灌木，主要分布于西北干旱鹽堿土荒漠地區。根據藏醫藥典《四部醫典》《晶珠本草》的記載，黑果枸杞主治心熱病、心臟病、月經不調、停經等[1]。現代醫學研究也證明黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力、降血糖、預防動脈粥樣硬化等功效[2-5]。其良好的醫用功效主要得益于果實中豐富的多酚、維生素E和黃酮等生物活性物質[6]。多酚能清除體內氧自由基，預防心腦血管疾病和抵抗機體老化[7]。維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素，能減少有毒物質的產生，保護細胞結構的完整，可以起到護膚美容和增加機體免疫力的功能，是最主要的抗氧化劑之一[8]。黃酮類化合物具備抵抗氧化和降低血脂活性等特性[9-10]。

在青海柴達木盆地，黑果枸杞集中分布于格爾木、都蘭、德令哈、烏蘭等盆地中東部地區，能抗風固沙，是荒漠戈壁重要的建群植物[2,11]。研究表明，柴達木盆地所產黑果枸杞原花青素質量分數高于新疆中、北、南部，寧夏，甘肅及內蒙所產黑果枸杞，表現出道地性特征[12-13]。黑果枸杞是典型的集生態價值、營養價值和藥用價值于一身的荒漠鹽堿地區原生樹種，對維持柴達木盆地生態平衡有重要意義，有極高的開發利用價值。

矯曉麗等[14]分析研究了青海可魯克湖周邊生長的野生黑果枸杞脂肪、多糖、總黃酮等營養成分質量分數；樊光輝等[8]分析了青海諾木洪地區人工栽培黑果枸杞氨基酸、維生素E、總黃酮等有效成分質量分數；劉桂英等[15]對比分析了青海諾木洪、格爾木、德令哈3個地區的野生黑果枸杞表型性狀。前人在探索黑果枸杞特性方面做了大量工作，但研究涉及地區范圍較小，相對柴達木盆地范圍內野生黑果枸杞來說存在一定局限性，系統調查柴達木盆地野生黑果枸杞的抗氧化組分質量分數的研究鮮有報道。本試驗測定了柴達木盆地野生黑果枸杞中多酚、總黃酮和維生素E質量分數，并對多酚和花青素組分構成做了初步探究，樣地范圍基本涵蓋柴達木地區野生黑果枸杞典型分布區，以期為黑果枸杞優質品種的選育、栽培、質量評價及迅速開發利用積累科學數據和資料。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

柴達木盆地位于東經90.27～99.27°、北緯35.00～39.33°之間。柴達木盆地為阿爾金山、祁連山和昆侖山所環繞的不規則內陸山間斷陷盆地，盆地西高東低，西寬東窄，略呈三角形，東西長約800 km，南北寬約300 km，面積 25.78×104km2，地勢自西北向東南緩傾，海拔為2 600～ 3 000 m。盆地內土壤為灰棕漠土、鹽土、風沙土、棕鈣土和少量粗骨土，研究區域內主要為灰棕漠土和鹽土。盆地屬高原大陸性氣候，以干旱為主要特征。本試驗在柴達木盆地中東部野生黑果枸杞典型原生分布區上進行。

1.2 試驗材料

黑果枸杞為2016年8月采摘于研究區內。每個采樣點隨機選擇20～30株長勢優良的植株，采摘成熟且大小均勻一致的鮮果1～2 kg，自然晾曬風干后，去除果蒂，粉碎過40目篩，-20 ℃保存待用。樣品采集信息見表1。

主要試劑：鹽酸(色譜純，上海安譜公司)、甲醇(色譜純，上海安譜公司)、沒食子酸、福林酚試劑、去離子水、蘆丁標準品、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、生育酚標準品。試劑除特殊注明外均為分析純。

主要儀器：超聲波清洗儀(KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司)、離心機(DIGICEN 21R，北京桑翌實驗儀器)、紫外分光光度儀(TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司)、索氏提取儀(WSC-SXT-02，北京同德創業科技有限公司)、液相色譜—質譜聯用儀(Q-Exactive，ThermoFisher)、高效液相色譜儀(L6-DP6，北京普析通用儀器有限責任公司)；色譜柱(Column Heater L6-C01，北京普析通用儀器有限責任公司)；在線脫氣機(DG55-2，北京同德創業科技有限公司)。

表1 樣品采集信息表Table 1 Information table of sample collection

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚質量分數測定 利用超聲輔助法提取黑果枸杞多酚[16]；利用福林酚法測定總酚質量分數[17]；利用超高效液相色譜—串聯四級桿質譜技術對多酚進行分離鑒定[18]，略做改動。

儀器條件為色譜系統：Dionex Ultimate 3000 RSLC；色譜柱：Hypersil GOLD aQ，100 mm× 2.1 mm，1.9 μm；流動相：A：0.9%乙酸水溶液；B：甲醇(色譜純)；進樣量： 3 μL；流速：0.3 μL·min-1；質譜系統：Thermo Q-Exactive。以沒食子酸為標準物質所得標準曲線回歸方程為y=2.156x+1.149 1(R2=0.990 5)。

1.3.2 總黃酮質量分數測定 利用有機溶劑法提取黑果枸杞總黃酮；利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定黑果枸杞中總黃酮的質量分數[19]，以蘆丁為標準物質所得標準曲線回歸方程為y=233.6x-0.353 3(R2=0.999 2)。

1.3.3 維生素E質量分數測定 維生素E的提取與測定方法參考劉紅河等[20]的反相高效液相色譜—二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)，略作 改動。

儀器條件為流動相甲醇(分析純)∶乙腈(分析純)= 93∶7，流速1.0 mL·min-1，柱溫 30 ℃， 280 nm波長掃描。以生育酚為標準物質所得標準曲線回歸方程為y= 1.787 4e-0.04x+1.258 4(R2=0.994 4)。

1.3.4 花青素鑒定及半定量分析 測定方法為UPLC-MS-MS[21]，略做改動。

用1%鹽酸—甲醇溶液反復提取粉粹樣品中的花青素，提取液過0.22 μm濾膜，用ThermoFisher Q-Exactive LC-MS/MS對樣品提取液進行測定分析。

儀器條件為色譜柱C18(100×4.6 mm)；二元流動相分別為A相： 0.9%乙酸水溶液，B相： 0.9%乙酸乙腈溶液；梯度洗脫條件如下：柱溫 30 ℃；流速0.3 mL·min-1；0～5 min，A相從97%降至90%；5～10 min，A相降至70%；10～15 min，A相降至60%；15～20 min，A相降至20%；25～25 min， A相提升至97%；27～30 min，A相保持97%。

1.4 數據分析

采用Excel 2010進行數據整理和繪制圖表，均以“平均值±標準誤”表示數據。采用DPS 7.05軟件中Duncan新復極差法進行顯著性 分析。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E質量分數

由表2可知，所檢測的12個樣品中總多酚質量分數為(8.19±0.50)～(28.60±0.54) mg·g-1，平均質量分數為17.92 mg·g-1，不同樣品間質量分數差異極顯著(P<0.01)。其中GEM2與MH總多酚質量分數極顯著高于其他樣品；NMH1極顯著低于其他樣品；DCD顯著高于DLH2，DLH2又顯著高于DGL；DLH2>ZJ>DLH1>GEM1>NMH2>WTMR，但未達顯著水平。總多酚質量分數格爾木、諾木洪地區栽培型高于野生型，德令哈地區栽培型與野生型質量分數相當。與閆亞美等[16]測得黑果枸杞多酚質量分數為8.25～87.77 mg·g-1的結果相似。

總黃酮的質量分數為(1.63±0.10)%～ (3.15±0.16)%，平均質量分數為2.39%，不同樣品間質量分數存在極顯著差異(P<0.01)。其中DCD、WTMR、GEM1、BKL、MH質量分數相對較高；DGL、DLH1、DLH2、NMH1總黃酮質量分數顯著低于其他地區(P<0.05)。總黃酮質量分數格爾木和德令哈地區栽培型與野生型差異不顯著，諾木洪地區栽培型質量分數顯著高于野生型。與李兆君等[19]利用分光光度法測得寧夏黑果枸杞的總黃酮質量分數為2.71%的結果相似。

維生素E的質量分數為(0.08±0.01)～ (0.96±0.02) mg·g-1，平均質量分數為0.51 mg·g-1，不同樣品間質量分數存在極顯著差異(P<0.01)。其中，DGL維生素E質量分數極顯著高于其他樣品；DLH1與DLH2極顯著低于其他樣品；BKL>GEM1>GEM2但未達顯著水平；GEM2顯著高于DCD，DCD>ZJ但未達顯著水平；ZJ顯著高于NMH1，NMH1>NMH2但未達顯著水平；WTMR質量分數低于NMH2但未達顯著水平，但顯著低于NMH1。維生素E質量分數野生型與栽培型不存在顯著差異。與王琴[22]測得新疆黑果枸杞維生素E質量分數為0.46 mg·g-1的結果相似。

表2 黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E質量分數Table 2 Contents of total polyphenols、total flavonoids and vitamin E in Lycium ruthenicum murr

注：不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著差異，不同大寫字母表示在0.01水平存在顯著差異；1表示野生型，2表示栽培型；下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level,and different uppercase letters indicate significant difference at 0.01 level; 1 means wild type,2 means cultivated type; the same below.

2.2 黑果枸杞多酚類物質(非花青素)的分離 鑒定

采用反相高效液相色譜—二極管陣列檢測法，在黑果枸杞中利用標準品對兒茶素、綠原酸、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸、沒食子酸、橙皮苷、山奈酚、柚皮素、柚皮甙、OPC-A2、OPC-B2、對香豆酸、根皮素、原兒茶酸、槲皮素、丁香、香草酸共18種多酚類物質進行了分離鑒定。由表3可知，其中咖啡酸、山奈酚、柚皮素、對香豆酸、槲皮素被最終檢測并定量。咖啡酸質量分數變幅為(1.31±0.03)～(11.99±0.32) mg·kg-1，馬海質量分數最高，諾木洪人工栽培質量分數最低。山奈酚質量分數變幅為(1.44±0.01)～(6.31±0.09) mg·kg-1，大柴旦最高，大格勒最低。柚皮素質量分數為(18.7±1.72)～(101.22±1.60) mg·kg-1，大柴旦最高，德令哈人工栽培最低。槲皮素質量分數烏圖美仁最高，大格勒最低，整體變幅為(55.33±2.50)～(131.83±2.21) mg·kg-1。供試的12個樣品中均含有咖啡酸、山奈酚、柚皮素和槲皮素，其中9個樣品中均檢測到了對香豆酸的存在，但DCD、DLH1、WTMR未檢出。推測可能是地理差異、遺傳差異等因素造成了不同樣品之間多酚組分構成不同，具體原因有待進一步研究探明。

表3 黑果枸杞多酚各組分質量分數Table 3 Content of each component of polyphenols in Lycium ruthenicum murr

2.3 黑果枸杞花青素類物質分離鑒定

如表4、圖1所示，檢測結果表明，柴達木黑果枸杞花青素母核主要有4種，分別是矮牽牛素(m/z317)、飛燕草素(m/z303)、錦葵素(m/z331)和矢車菊素(m/z287)。

黑枸杞花青素主要由這4種母核鍵合糖苷等物質衍生而來，在供試樣品中共發現12種花青素類化合物。其二級質譜碎片大多是由母核離子失去糖基而得到，因此具有一定的特征。通過對母核離子以及碎片的特征信息進行分析鑒定，并結合文獻資料，對其中10 種花青素類化合物進行了命名，結果如表5所示。

表4 黑果枸杞主要花青素母核Table 4 Main anthocyanin core of Lycium ruthenicum murr

圖1 黑果枸杞花青素母核結構式Fig.1 Structural formula of anthocyanin mother core of Lycium ruthenicum murr

表5 黑果枸杞花青素信息Table 5 Athocyanins extract of Lycium ruthenicum murr

12種花青素類化合物相對質量分數在不同樣品間有所變化(表6)。結果表明矮牽牛素-3-O-順式香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷(或矮牽牛素-3-O-反式香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷)是柴達木野生黑果枸杞花青素的主要成分，占花青素總量的 49.42%～79.13%。但馬海地區(MH)黑果枸杞矮牽牛素-3-O-對香豆酸-槐糖苷-5-O-葡萄糖苷占總花青素的40.00%，較矮牽牛素-3-O-香豆酰蕓香糖-5-O-葡萄糖苷高1.62%。總的來說不同采集點黑果枸杞花青素總體組成模式基本相同，但個體之間各類母核離子質量分數及各花青素濃度不同，造成這一差異的原因可能是地理、氣候環境、地球化學元素以及遺傳等多因素共同作用的結果，有待進一步深入研究。

表6 黑果枸杞各花青素的相對質量分數Table 6 Relative content of each anthocyanin in Lycium ruthenicum murr %

3 討論與結論

果實中營養物質質量分數的高低往往決定了果實品質的好壞，果實中營養物質的質量分數可以作為評價果實質量的依據和參考[28]。總多酚、總黃酮、維生素E是重要抗氧化物質組分。有研究表明，紅果枸杞的總多酚、總黃酮和維生素E質量分數分別為2.43 mg·g-1、1.67%和0.11 mg·g-1[29-30]，黑果枸杞總多酚、總黃酮和維生素E的平均質量分數分別為17.92 mg·g-1、 2.39%和0.51 mg·g-1，是紅枸杞質量分數的 7.37倍、1.43倍和4.54倍，黑果枸杞營養價值明顯優于紅果枸杞。菲爾杜德和寶石紅兩個品種的紅樹莓總多酚質量分數分別為3.74 mg·g-1和2.87 mg·g-1[31]，供試黑果枸杞的總多酚質量分數平均達17.92 mg·g-1，明顯高于紅樹莓。

德令哈、格爾木、諾木洪地區野生黑果枸杞的總多酚質量分數分別為14.61 mg·g-1、15.20 mg·g-1、8.19 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞多酚質量分數分別為17.70 mg·g-1、28.60 mg·g-1、16.14 mg·g-1；德令哈、格爾木、諾木洪地區野生黑果枸杞總黃酮質量分數分別為 1.84%、2.85%、1.63%，人工栽培黑果枸杞總黃酮質量分數分別為1.78%、2.44%、2.34%；德令哈、格爾木、諾木洪地區野生黑果枸杞維生素E質量分數分別為0.10 mg·g-1、0.71mg·g-1、0.36 mg·g-1，人工栽培黑果枸杞維生素E質量分數分別為0.08 mg·g-1、0.65 mg·g-1、0.32 mg·g-1。人工栽培與野生黑果枸杞營養成分質量分數相當或人工栽培質量分數較野生黑果枸杞顯著提升，說明人工栽培不會影響黑果枸杞營養品質，且生長環境良性改變有助于黑果枸杞營養物質的積累。這一發現與祁銀燕等[32]研究結果一致。

本研究發現矮牽牛素(m/z317)、飛燕草素(m/z303)、錦葵素(m/z331)和矢車菊素 (m/z287)是柴達木黑果枸杞花青素的主要母核物質，其果實中所含花青素主要由這4種母核物質鍵合糖苷等衍生而來。前人研究認為黑果枸杞不含有矢車菊素衍生物[24]，本研究發現矢車菊素也是黑果枸杞花青素的主要母核物質，補充了前人研究結果。呂玉姣等[33]在新疆庫爾勒地區黑果枸杞中發現了天竺葵素衍生物，而在本研究中未檢測到，推測可能是地理因素導致的這一差異。在柴達木黑果枸杞中共發現12種花青素類化合物，并對其中10種進行命名。不同地區黑果枸杞多酚和花青素的構成模式基本相同，但各組分的質量分數、占比均不同，具體原因有待進一步研究。本試驗供試樣品基本覆蓋了柴達木盆地黑果枸杞資源類型，研究結果對柴達木盆地黑果枸杞資源的人工選育和栽培提供了數據基礎和理論 指導。