黃連提取物對TGEV的體外抑制效果

朱買勛，唐紅梅，陳春林，閆志強，曹 政

(重慶市畜牧科學院，重慶榮昌 402460)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一種接觸性傳染病。該病傳播方式廣，能通過污染的飼料、圈舍、糞便、病豬的接觸等途徑傳播；易感動物群體多，能在各種日齡段豬群間暴發，尤其是斷奶前仔豬，多以相對密集型飼養，極易形成大規模暴發；傳播速度快，豬群一旦感染豬傳染性胃腸炎，會經過各種途徑在豬群間迅速傳播，病毒在動物體內繁殖形成大規模的感染；致病性強，病毒入侵仔豬后，迅速破壞仔豬胃腸道菌群和黏膜組織結構，仔豬表現出嘔吐、腹瀉、脫水等臨床癥狀，發病率高達到87.97%，病死率達到89.90%[1-2]；防治效果差，目前無特效治療藥物，主要是通過增強免疫和對癥治療的藥物對豬群進行防治，嚴重危害養豬業的發展，2019年被世界動物衛生組織(Office international des epizooties，OIE)列為烈性傳染病[3]。面對臨床中TGEV致使的較大危害和經濟損失，開發能夠高效防治的藥物是應對該問題的主要措施。根據TGEV主要寄生于宿主細胞的生物學特性，開發防治TGEV的理想藥物應對病毒呈選擇性抑制作用，穿入細胞并對細胞無損害作用。因此，本試驗根據TGEV致使豬的臨床變化，選擇具有抗菌、抗病毒、抗腹瀉、抗氧化、抗潰瘍等作用功效的中藥黃連進行提取制備成黃連提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)，在朱買勛等[4-5]前期研究的連梅提取物能有效防治仔豬濕熱瀉痢，防治TGEV為陽性的仔豬腹瀉的基礎上，著力于CRE抑制TGEV增殖、保護宿主細胞、激發宿主細胞抗病毒相關因子的分泌等研究，明確CRE體外抑制TGEV的作用效果及其作用方式。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞和病毒 豬腎細胞(PK-15)，中國科學院典型培養物保藏中心提供，編號：GDC061。傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)，購于ATCC，編號：VR-763。

1.1.2 試驗藥物 黃連提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)由黃連經過醇提，硫酸反應，鹽酸沉淀，過濾，純化結晶制備而成。測定后鹽酸小檗堿含6.37%，黃連堿含3.03%，巴馬汀含 0.11%。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒(批號：0000197548)、反轉錄試劑盒(批號：0000219081)、PCR Green Master Mix(批號：0000219579)、qPCR Master Mix(批號：0000213128)均購于普洛麥格生物技術有限公司，BM2000 DNA Marker(批號：716382CC)、PRMI 1640(批號：0023016)、胎牛血清(批號：1528235)均購于博邁德生物有限公司。

1.1.4 主要儀器 ABI Veriti 96梯度PRC儀，美國應用生物系統公司產品；GBOX SYDR4/2752凝膠圖像分析儀，美國伯騰儀器有限公司產品；DYY-7C電泳儀，北京市六一儀器廠產品；ABI 7500熒光定量PRC儀，美國應用生物系統公司產品；Avanti J-26 XP高速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司產品；紫外分光光度計，德國艾本德股份公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 病毒TCID50的測定 采用 Reed-Muench法測定，將TGEV病毒液分別用細胞維持液(含2%血清的DMEM培養液)依次10倍稀釋成10-1，10-2，10-3，…，10-7共7個稀釋度。將各稀釋度病毒懸液接種100 μL于長有單層細胞的96孔板，各設8個復孔。37 ℃、5% CO2孵育2 h后吸取出病毒液，加入細胞生長維持液液，置于5%CO2、37 ℃孵育箱培養，每天觀察記錄細胞病變(Cytopathic effect，CPE)，連續觀察7 d，按Reed-Muench法計算病毒致半數細胞病變的滴度(TCID50)[6]。

TCID50=Anti{B+(50-小于50%抑制百分率)/(大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率)×C}

式中：B=lg大于50%抑制百分率；C=lg稀釋倍數。

1.2.2 CRE對PK-15細胞最大無毒濃度的測定 采用MTT檢測法，將細胞懸液稀釋成1×105個/mL接入96孔細胞培養板，長滿單層后，加入含有CRE質量濃度為10-1～10-8g/mL的維持液(血清濃度2%)，每孔100 μL，每個濃度重復6孔，同時設正常細胞對照，置培養箱中培養，每日觀察細胞形態變化，72 h后，采用MTT法檢測細胞的吸光值(OD值)，計算PK-15細胞存活率，篩選出CRE對PK-15細胞的最大無毒濃度。細胞存活率(%)=各濃度藥物組OD值/空白組OD值×100%。

1.2.3 CRE對TGEV感染PK-15細胞保護作用 將細胞懸液稀釋成1×105個/mL接入96孔細胞培養板，細胞豐度達到80%后，分別設置空白組、病毒組、藥物對照組和3個試驗組，每個組6孔，正常細胞對照組添加維持液200 μL作為對照；病毒組細胞添加100 μL的病毒液感作2 h后，添加維持液培養72 h作為病毒對照；藥物對照組添加最大無毒濃度的藥物200 μL作為藥物對照；試驗1組先將病毒和終濃度為最大無毒濃度的藥物4 ℃作用2 h，再添加200 μL至細胞上培養72 h；試驗2組細胞先感染病毒2 h后，棄病毒液，添加終濃度為最大無毒濃度的維持液200 μL培養72 h；試驗3組細胞先添加終濃度為最大無毒濃度的藥物200 μL作用48 h，再添加病毒100 μL感染2 h，棄病毒液，添加維持液200 μL培養24 h。試驗結束后各組細胞棄培養液，避光添加MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，添加50 μL的二甲基亞砜，充分混勻溶解后，570 nm波長檢測OD值，計算PK-15細胞活率。

1.2.4 CRE對TGEV增殖抑制 同“1.2.3”進行分組和試驗處理，試驗結束后，提取病毒RNA，電泳檢測總RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA的純度，反轉錄為cDNA，參照表1中TGEV引物進行RT-PCR擴增檢測TGEV轉錄水平，反應體系25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O補至25 μL。反應程序：95 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性 45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 個循環，72 ℃再延伸10 min。

1.2.5 細胞抗病毒相關因子的調節 同“1.2.3”進行分組和試驗處理，試驗結束后，提取細胞RNA，反轉錄為cDNA，檢測相關因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3的表達量變化。參照表1中引物進行RT-PCR擴增檢測IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3基因的轉錄水平。參照表1中各基因引物進性RT-PCR擴增檢測轉錄水平，反應體系 25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O補至25 μL。反應程序：95 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性 45 s，各基因參照表1退火溫度設置，退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 個循環，72 ℃再延伸10 min。

表1 用于分析豬相關基因的引物序列 Table 1 Primer sequence for analysis of pig-related genes

表2 TGEV感染PK-15細胞結果Table 2 TCID50 results of PK-15 cells infected with TGEV

1.2.6 數據分析及處理 試驗數據采用Excel 2003進行收集，SPSS 20.0軟件進行方差分析，結果用“平均值±標準差”表示。RT-PCR結果中基因表達強度分別以絕對拷貝數/β-actin絕對拷貝數表示。將病毒組的表達量設置為1×，計算各個基因相對于正常組的表達變化水平。

2 結果與分析

2.1 毒滴度測定

TGEV病毒液經感染細胞試驗檢測出能使細胞發生病變的數量，按Reed-Muench法計算出TGEV的TCID50為10-3.6/100 μL 稀釋的病毒液(表2)。

2.2 CRE對PK-15細胞最大無毒質量濃度測定結果

從表3可知，黃連提取物質量濃度1×10-1g/L時，由于高質量濃度的藥物穿透進入細胞后再細胞內進性殘留，影響測定的吸光值；質量濃度為1×10-2g/L組的細胞存活率低至25.49%，極顯著低于1×10-4g/L以后的劑量組和空白組(P<0.01)；質量濃度為1×10-3g/L組的細胞存活率低至 57.22%，顯著低于1×10-4g/L以后的劑量組和空白組(P<0.05)；質量濃度為1×10-4g/L組，細胞存活率達到93.39%以上，之后的質量濃度組間差異不顯著(P>0.05)，確定黃連提取物的最大無毒質量濃度為1×10-4g/L。

表3 不同濃度的CRE對PK-15細胞的毒性Table 3 Toxic effects of different concentrations of CRE on PK-15 cells

注：同列數據后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different uppercase letters in the same column indicate that difference is extremely significant(P<0.01), and the lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same below.

2.3 CRE對TGEV感染PK-15細胞存活率的 影響

從圖1可見，空白組細胞生長良好，呈鋪石路樣；接種TGEV病毒后病毒組大部分細胞出現拉絲鋪網和死亡等現象，細胞存活率極顯著低于空白組和其他試驗組(P<0.01)；藥物對照組保持較高的細胞存活率，與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)；試驗1組的細胞形態未出現典型的拉絲鋪網現象，但細胞存活率只達到 54.12%，極顯著低于空白組和試驗3組(P< 0.01)；試驗2組大量的細胞出現病變和死亡，細胞存活率極顯著低于空白組和試驗2組(P<0.01)；試驗3組細胞極少出現病變，細胞存活率達到 87.67%，極顯著高于試驗1組、試驗2組和病毒組(表4，P<0.01)。

A.空白對照組；B.病毒組；C.藥物對照組；D.試驗1組；E.試驗2組；F.試驗3組

表4 TGEV感染后PK-15細胞存活率Table 4 PK-15 cells viability after TGEV infection

2.4 CRE對TGEV增殖抑制效果

從圖2可知，空白組和藥物對照組2個未感染TGEV的細胞病毒檢測為陰性，經CRE作用后，3個試驗組病毒轉錄倍數分別降為病毒組的0.438、0.603、0.264倍，并出現極顯著差異(P<0.01)，其中試驗3組TGEV轉錄倍數顯著低于試驗2組(P<0.05)；試驗1組低于試驗2組，試驗3組低于試驗1組，但差異不顯著(P>0.05)，說明CRE經過3種方式均可以抑制TGEV的 增殖。

2.5 CRE對細胞抗病因子轉錄的影響

從圖3可知，IFN-α基因轉錄結果：病毒組細胞IFN-α基因的轉錄量升高，但與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)；試驗1組、試驗2組、試驗3組細胞IFN-α基因的轉錄量分別為病毒組的7.13倍、4.35倍、8.51倍，3個試驗組均極顯著高于空白組、病毒組和藥物對照組(P< 0.01)，且試驗1組和試驗3組極顯著高于試驗2組(P< 0.01)，試驗3組顯著高于試驗1組(P< 0.05)。

IFN-β基因轉錄結果：病毒組、藥物對照組、空白組間細胞IFN-β基因的轉錄量間差異不顯著(P>0.05)；試驗1組、試驗2組、試驗3組細胞IFN-β基因的轉錄量分別為病毒組的3.34倍、 3.31倍、5.98倍，3個試驗組均極顯著高于空白組、病毒組和藥物對照組(P<0.01)，且試驗3組極顯著高于試驗1組和試驗2組(P<0.01)。

IFN-γ基因轉錄結果：病毒組與空白組間細胞IFN-γ基因的轉錄量差異不顯著(P>0.05)，試驗1組、試驗2組、試驗3組、藥物對照組細胞IFN-γ基因的轉錄量分別為病毒組的2.28倍、 2.00倍、3.01倍、1.89倍，其中試驗3組顯著高于試驗1組(P<0.05)，極顯著高于試驗2組、試驗3組、藥物對照組、病毒組和空白組有(P< 0.01)；試驗1組、試驗2組和藥物對照組顯著高于空白組(P<0.05)，極顯著高于病毒組(P<0.01)。

IRF-3基因轉錄結果：病毒組細胞IRF-3基因的轉錄量低于空白組，但差異不顯著(P> 0.05)；試驗1組、試驗2組、試驗3組、藥物對照組細胞IRF-3基因的轉錄量分別為病毒組的 50.63倍、43.49倍、55.74倍、39.94倍，均極顯著高于空白組、病毒組(P<0.01)，且試驗3組顯著高于試驗2組和藥物對照組(P<0.05)。

“+”表示添加，“1+”和“2+”分別表示添加的順序，“1+”為先添加，“2+”表示后添加；柱標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

“+” indicates addition, “1+” and “2+” indicate order of addition, respectively, “1+” added first, “2+” added；different uppercase letters in the column indicate that difference is extremely significantP<0.01, and the lowercase letters indicate that the difference is significantP<0.05; the same below

圖2 CRE對TGEV增殖抑制
Fig.2 CRE inhibition on TGEV proliferation

圖3 黃連提取物作用后細胞抗病毒相關因子的轉錄變化Fig.3 Transcriptional changes of factors related to cellular antiviral after action of Coptidis Rhizoma extract

3 討 論

TGEV在感染宿主細胞的過程中，病毒與細胞膜上氨肽酶受體(pAPN)的識別位點特異性結合，并吸附在細胞膜表面，在內吞和細胞融合作用下侵入宿主細胞胞漿內，啟動繁殖周期，促進病毒在細胞內繁殖[7-8]。試驗中，通過3種不同方式感染病毒和添加藥物，試驗結果也出現明顯差異，其中先感染病毒在添加藥物作用組的PK-15細胞大量出現死亡，有明顯的CPE，細胞存活率達到40.69%，說明細胞受到TGEV入侵后造成了大量的細胞損傷；病毒和藥物作用后，同時感染細胞組的細胞得到了一定的緩解，CPE明顯減少，細胞存活率達到54.12%，其原因可能是藥物直接與病毒接觸后，直接起到滅活病毒的作用，降低病毒的感染能力，也有可能是藥物同時作用于細胞后，保護細胞免受TGEV入侵，降低其損傷；先添加藥物作用后再感染病毒，細胞存活率達到 87.67%，TGEV造成的細胞損傷和病變明顯降低，可能是添加藥物作用后可以有效刺激細胞產生抗病毒相關物質，有效抵御TGEV入侵來達到保護細胞的效果。同時檢測不同方式作用后TGEV N基因的轉錄變化，3種不同的作用方式TGEV N基因的轉錄也存在著顯著差異，試驗3組<試驗1組<試驗2組，結果顯示試驗3組的給藥方式效果最佳。由此可以表明藥物添加的順序對抵御TGEV感染有明顯的作用效果，充分體現出黃連提取物主要是以預防的方式對TGEV進性防治。

在抗病毒過程中，激發細胞分泌抗病毒相關因子是抵御病毒的有效途徑。細胞在受到病毒的持續刺激后可促使干擾素通過自分泌和旁分泌作用產生，與同源性細胞表面受體結合形成干擾素-受體復合物而發揮其生物學作用[9]。病毒刺激后，PK-15細胞中只有IFN-α轉錄量有升高趨勢，激發細胞抗病毒的作用，但與空白組相比較差異不顯著(P>0.05)，說明細胞自身分泌的IFN-α不足與達到有效抑制TGEV的作用。在藥物刺激后，IFN-β、IFN-γ、IRF-3轉錄量升高，IFN-γ顯著高于空白組(P<0.05)，極顯著高于病毒組 (P<0.01)；IRF-3極顯著高于空白組和病毒組 (P<0.01)，顯示黃連提取物可以促使PK-15細胞分泌一些抗病毒相關因子。通過對3中不同方式進行作用后，IFN-α、IFN-β、IRF-3轉錄量極顯著高于空白組、病毒組和藥物對照組(P<0.01)，IFN-γ也顯著(P<0.05)或者極顯著高于空白組和病毒組(P<0.01)。其中IFN-α可以通過增強免疫對病毒感染細胞的免疫殺傷活性，也可以增強巨噬細胞的吞噬功能和細胞毒活性來參與抗病毒作用[10]。IFN-β也主要是參與抗病毒、抗腫瘤作用，其作用方式與IFN-α相似。IFN-γ在參與抗病毒的同時，還參與了部分的免疫調節，促進rRNA合成，促使細胞內的抗原如病毒肽遞呈給輔助性T細胞，調節K細胞、NK細胞、巨噬細胞的功能活性[11-12]。激活表達高水平的誘導性一氧化氮合成酶，進而催化精氨酸產生的一氧化氮直接殺傷或產生過氧亞硝酸鹽殺傷病毒[12]。IRF-3能結合并活化干擾素α的啟動子，啟動IFN-α的表達，通過IRF-3的病毒誘導活化而使IFN-β基因表達[13]。同時，IRF-3還參與DNA的損傷修復，抑制病毒誘導的細胞凋亡，進而達到抗病毒效果[14]。因此，可以推測3個試驗中，先添加藥物刺激后會使細胞產生一定量的細胞因子，在受到病毒入侵后，細胞崩解導致抗病毒相關細胞因子擴散到細胞間隙，增強抗病毒效果。