大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因的鑒定及生物信息學分析

張迎春，孫天歌，張小雪，梁其干，李艷軍，孫 杰

(石河子大學 農學院，新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832003)

黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，是制約中國棉花生產的主要因素之一。中國棉花黃萎病主要是大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)和黑白輪枝菌(Verticilliumalboatrum)侵染所致。大麗輪枝菌是一種土傳性病原真菌，可侵染200多種植物，其寄主主要是雙子葉植物[1-2]。大麗輪枝菌的微菌核能在土壤中存活30～50年，當感應到寄主植物根際釋放的根系分泌物后，微菌核開始萌發產生感染性菌絲可定植于根皮層，進而擴散到木質部產生孢子，導致作物的維管束受到阻塞，出現枯萎癥狀，發育遲緩，黃化和壞死[3-5]，嚴重影響棉花的產量和品質。因中國氣候變化多樣，大麗輪枝菌在不同環境條件下產生了許多具有豐富遺傳多樣性的生理小種，田間致病性易發生變異，出現強致病力的類型[6-7]，大麗輪枝菌的防治目前仍無有效的生物及化學措施。大麗輪枝菌全基因組數據的公布為其致病分子機制的研究提供了基礎，為抗病新品種的開發提供了新路線[8]。

植物細胞壁由纖維素、半纖維素以及果膠等多糖組成，這些組分與木質素一起形成致密的網狀結構，形成植物的支撐結構[9]。在大麗輪枝菌侵染植物過程中分泌大量的細胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes, CWDEs)[10]。細胞壁降解酶不僅可降解植物細胞壁中的多糖，而且也破壞植物細胞壁結構，為病原微生物的入侵和攝取營養提供條件[11]。細胞壁降解酶包括角質酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶、果膠裂合酶、木聚糖酶、內葡聚糖酶G1、β-1,4-葡萄糖苷酶和蔗糖非發酵蛋白激酶等[11]。角質酶VdCUT11水解植物細胞壁的角質層促進大麗輪枝菌的侵染[12]。果膠裂解酶VdPL1可誘導植物免疫反應，同時作為一個毒力因子參與大麗輪枝菌的侵染[13]。除角質酶和果膠裂解酶外，纖維素酶、聚半乳糖醛酸酶、木聚糖酶等在大麗輪枝菌侵染植物的過程中也發揮了重要作用[13]。

植物細胞的感染需要半纖維素的降解[14]，木聚糖是植物細胞壁中半纖維素的主要成分。在蘋果樹爛腐病研究中，木聚糖酶被證明與致病性或毒力有關[15]。在灰霉病菌研究中，木聚糖酶基因xyn11A缺失突變體的致病力顯著降低，但未完全喪失致病力[16]。木聚糖酶屬于水解酶類，主要包括有β-1,4-內切木聚糖酶、β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等[17]。其中，β-1,4-內切木聚糖酶是使木聚糖完全水解最關鍵的酶，其作用于木聚糖主鏈的木聚糖苷鍵，隨機切斷主鏈內的糖苷鍵，水解木聚糖而生成分子量大小不同的寡糖[18]。β-1,4-內切木聚糖酶能使組成細胞壁的不溶性木聚糖變成可溶性木聚糖，從而迅速降解細胞壁[19]。在病原菌侵染植物的過程中，β-1,4-內切木聚糖酶參與了細胞壁的降解，表明它在致病過程中發揮著重要作用[20]。然而，目前大麗輪枝菌中木聚糖酶研究仍較少，本研究從大麗輪枝菌基因組中鑒定β-1,4-內切木聚糖酶基因并進行生物信息學分析，同時對這些基因在棉花不同抗感品種根系分泌物中的表達模式進行分析，旨在揭示β-1,4-內切木聚糖酶基因與大麗輪枝菌致病性的聯系，為進一步研究β-1,4-內切木聚糖酶基因在大麗輪枝菌致病過程中的作用以及揭示致病的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

大麗輪枝菌V991菌株由石河子大學綠洲生態農業重點實驗室保存，2個陸地棉品種‘新陸早7號’(感黃萎病)和‘中植棉2號’(耐黃萎病)均由石河子大學棉花研究所提供。

1.1.1 棉花根系分泌物的收集 將‘新陸早7號’和‘中植棉2號’品種的種子浸泡在1%(1 g NaClO加入100 mL H2O)NaClO溶液中進行表面消毒，用無菌蒸餾水反復沖洗后種在經過高溫高壓(121 ℃，60 min)滅菌處理的沙土中。每個品種種植2盆，每盆9株苗，光周期為16 h/8 h，溫度28 ℃，每3 d用霍格蘭營養液澆灌1次。 45 d后，從沙土中取出棉苗，用2 L滅菌水浸泡砂土，使根系分泌物充分溶解在水中，用細菌過濾器 (0.22 μm)過濾水溶液，在冷凍干燥機中濃縮至0.5 L。

1.1.2 大麗輪枝菌的培養與取樣 將貯存的大麗輪枝菌V991分生孢子培養于察氏培養基上，25 ℃黑暗條件下培養5 d。收集新鮮的分生孢子，分別稱取0.5 g分生孢子接菌于5 mL不同抗感棉花品種的根系分泌物中。25 ℃ 220 r/min搖培0、6和12 h后，收集V991的分生孢子。根系分泌物培養前0 h的大麗輪枝菌樣本，標記為CK；感病品種‘新陸早7號’根系分泌物培養6 h和12 h的樣本，分別標記為VDX6和VDX12；耐病品種‘中植棉2號’根系分泌物培養6 h和12 h的樣本，分別標記為VDZ6和VDZ12；同時用水培養大麗輪枝菌，培養6 h和12 h的樣本分別標記為VDW6和VDW12。每處理2個重復用于轉錄組測序，共構建14個文庫。

1.2 方 法

1.2.1 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因的鑒定 從http://fungi.ensembl.org/Verticillium_dahliae/Info/Index/ 下載大麗輪枝菌全基因組編碼序列CDS(Coding sequence) GCF_000150675.1_ASM15067v2-rna序列文件、GCF_000150671_ASM15067v2-protein 蛋白質序列文件、GCF_000150675.1_ASM15067v2_ genomic全基因組序列文件，以及Verticillium_dahliaeASM15067v2.42 GFF3文件。利用TBtools v 0.66443軟件對GFF3文件中所有β-1,4-內切木聚糖酶基因進行搜索，同時在CDS、蛋白質、全基因組序列文件中獲取基因對應的cDNA序列、蛋白質序列以及基因組序列。

1.2.2 β-1,4-內切木聚糖酶基因的氨基酸序列分析 利用ExPAsy(http://web.expasy.org)工具在線分析β-1,4-內切木聚糖酶基因一級結構的基本理化性質，包括氨基酸序列大小、分子質量和等電點等。利用在線工具WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)和 TMHMM(http://www.cBMs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對編碼蛋白質的亞細胞定位情況和跨膜結構域進行預測[21]。

1.2.3 多重序列比對和進化樹分析 采用DNAMAN 6.0和ClustalX 2.0對β-1,4-內切木聚糖酶氨基酸序列進行多重序列比對。利用SMART工具在線預測11個β-1,4-內切木聚糖酶蛋白序列的信號肽和結構域，并用DOG 1.0軟件進行繪制。以11個β-1,4-內切木聚糖酶蛋白序列的主結構域為探針序列，在CaZy數據庫中(http://www.cazy.org/)查找其他物種中的相應蛋白[22]，去除重復以及不完整序列后，挑選9條其他物種中的β-1,4-內切木聚糖酶蛋白序列用于進化樹分析。利用MEGA 6.0提供的ClustalW程序對大麗輪枝菌及其他物種中的β-1,4-內切木聚糖酶基因進行多重序列比對，然后通過鄰位相連法構建基因的復合進化樹。

1.2.4 β-1,4-內切木聚糖酶基因的染色體分布 從大麗輪枝菌全基因組數據庫中獲得β-1,4-內切木聚糖酶基因染色體分布以及長度信息，利用TBtools v0.66443軟件繪制β-1,4-內切木聚糖酶基因的染色體分布圖。

1.2.5 β-1,4-內切木聚糖酶基因結構分析 從全基因組數據庫下載該基因的外顯子和內含子信息，利用在線軟件Gene Structure Display Server (GSDS)(http://gsds.cBMi.pku .edu.cn/)分析大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因外顯子-內含子的數目及分布。

1.2.6 大麗輪枝菌樣本RNA的提取及轉錄組測序 采用RNA simple total kit試劑盒(Tiagen，中國北京)提取大麗輪枝菌總RNA，利用Nanodrop○R2000分光光度計(Thermo Scientific，Wilmington，de，USA)和Agilent 2100生物分析儀(Agilent TeGHnologies，Santa Clara，CA，USA)分別檢測RNA的純度和完整性，利用Qubit○R2.0熒光計(Thermo Scientific，Wilmington，de，USA)對RNA的濃度進行精確測量，最終獲得高質量的RNA樣本用于RNA測序。采用Illumina HiSeqTM4000測序平臺進行轉錄組測序，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，轉錄組數據已上傳至NCBI SRA數據庫中，登錄號為PRJNA545805。

1.2.7 β-1,4-內切木聚糖酶基因對不同棉花抗感品種根系分泌物的響應分析 對轉錄組測序獲得的raw reads進行質量控制后，利用HISAT軟件將得到的clean reads比對到大麗輪枝菌的參考基因組數據(http//www.broadinstitute.org/annotation/genome/Verti- cillium dahlia /Blast.html)。采用HTSeq軟件對各樣品進行基因表達水平分析，使用的模型為union，分別統計單個基因的表達水平。FPKM(fragments per kilobase of exon per millon fragments mapped)為每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數目，同時考慮測序深度和基因長度對fragments計數的影響，是目前最為常用的基因表達水平估算方法[22]。根據轉錄組測序結果獲得β-1,4-內切木聚糖酶基因的FPKM值，并采用HemI軟件繪制基因在不同抗感棉花品種根系分泌物中的表達熱圖，使用Excel 2010制作基因表達折線圖。

2 結果與分析

2.1 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因的鑒定

通過TBtools軟件查找GFF3文件中所有 β-1,4-內切木聚糖酶基因，共獲得11條關于β-1,4-內切木聚糖酶基因的記錄，分別為VDAG_03385～VDAG_08273(表1)。這些基因編碼序列(coding sequence, CDS)長度為666～1 314 bp，編碼221～437個氨基酸，蛋白質分子質量為23.90～47.64 ku，理論等電點為5.09～10.00。對各成員序列的亞細胞定位預測表明，這些基因大多(7個)為細胞膜外蛋白，部分定位于細胞膜、線粒體、細胞質基質和細胞核中(表1)。其結果與角毛殼菌生物信息學分析一致，說明該酶蛋白主要在胞外發揮水解木聚糖的生物學作用[23]。

2.2 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶的保守域分析

利用蛋白跨膜結構域在線分析工具TMHMM(http://www.cBMs.dtu.dk/services/)發現，β-1,4-內切木聚糖酶蛋白不含跨膜結構域(transmembrane domain, TM)。利用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batGH.pl)對11個β-1,4-內切木聚糖酶蛋白序列進行信號肽和結構域預測，分析發現11個酶中 VDAG_03790、 VDAG_05042、 VDAG_05043、 VDAG_05294和 VDAG_06165均含有糖苷水解酶Glyco_hydro11結構域，其中 VDAG_06165還含有一個fCBD(cellulse biding domain；真菌纖維素結合域)結構域； VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744均含有糖苷水解酶Glyco_hydro10結構域； VDAG_05509和 VDAG_03808均含有糖苷水解酶 Glyco_Hydro 43結構域，其中 VDAG_03808還含有一個CBM(carbohydrate binding modules；碳水化合物結合域)結構域(圖1)。VDAG_03385、 VDAG_08273、 VDAG_04744、 VDAG_06165V、DAG_03809和 VDAG_05509含有不同長度的信號肽(圖1)。

將 VDAG_03790、 VDAG_05042、 VDAG_05043、 VDAG_05294和 VDAG_06165蛋白的Glyco_hydro11結構域進行多重序列比對，發現GGKGW、YGW、EYY和STR區域具有較強的保守性(圖2-A)。將 VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744蛋白的Glyco_hydro10的結構域進行多重序列比對，保守區域為WDVVNE、ADP、NDY和TELD(圖2-B)。對VDAG_03808和VDAG_05509蛋白的Glyco_Hydro 43結構域進行多重序列比對，KGVRD和IATDL區域具有較強的保守性(圖2-C)。這些保守性區域可能與木聚糖酶的催化相關[24-25]。

表1 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因的特征Table 1 Characterization of Endo-β-1,4-xylanase genes in V.dahliae

黑色表示信號肽；深藍色表示Glyco_hydro10結構域；淺藍色表示Glyco_hydro11結構域；粉色表示Glyco_Hydro 43結構域；黃色表示fCBD結構域；橙紅色表示CBM結構域

The black indicates signal peptide;Dark blue indicates the Glyco_hydro10 domain; Light blue indicates the Glyco_hydro11 domain; Pink indicates the Glyco_Hydro 43 domain; Yellow indicates the fCBD domain;Orange red indicates the CBM domain

圖1 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶蛋白結構域分析
Fig.1 Domains analysis of Endo-β-1,4-xylanase proteins inV.dahliae

A為VDAG_03790、VDAG_05042、VDAG_05043、VDAG_05294和VDAG_06165蛋白Glyco_hydro11結構域多重序列比對；B為VDAG_08273、VDAG_03385、VDAG_03809和VDAG_04744蛋白Glyco_hydro10結構域多重序列比對；C為VDAG_03808和VDAG_05509蛋白Glyco_Hydro 43結構域多重序列比對。灰色和黑色區域分別代表 75%以上和 100%的保守區。黑色方框表示氨基酸保守區域

A indicates a multiple sequence alignment of Glyco_hydro11 domain in VDAG_03790, VDAG_05042, VDAG_05043, VDAG_05294, and VDAG_06165 proteins; B indicates a multiple sequence alignment of Glyco_hydro10 domain in VDAG_08273, VDAG_03385, VDAG_03809 and VDAG_04744 proteins; C indicates a multiple sequence alignment of Glyco_Hydro 43 domain in VDAG_03808 and VDAG_05509 proteins.The gray and black areas represent more than 75% and 100% of conservative regions, respectively.Black boxes indicate regions of amino acid conservation

圖2 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶蛋白結構域多重序列比對
Fig.2 Multiple sequence alignment of domains in Endo-β-1,4-xylanase proteins fromVerticilliumdahliae

2.3 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶蛋白的進化關系分析

在CaZy數據庫中查找并隨機選取9個來自其他物種的β-1,4-內切木聚糖酶蛋白記錄，其中XP_018153852.1(十字花科炭疽病菌)、EPS36346.1(捕食線蟲真菌)、ABR14629.1(宇佐美曲霉)和RGP60782.1(擬枝孢鐮刀菌)屬于糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)10家族成員，BAE71410.1(黑色素短梗霉)、ACS96449.1(嗜酸真菌)和ACR83565.1(黑曲霉)屬于11家族成員，XP_013423968.1(出芽短梗霉)和THY53895.1(出芽短梗霉)屬于43家族成員。利用MEGA 6.0軟件將上述9個蛋白與11個大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶蛋白進行進化關系分析，結果如圖3所示，20個糖苷水解酶基因被清晰地分為3組。 VDAG_06165、 VDAG_03790、 VDAG_05294、VDAG_0 5042和 VDAG_05043與其他物種中11家族成員聚為一類； VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744與其他物種中10家族成員聚為一類； VDAG_05509和 VDAG_03808與其他物種中43家族成員聚為一類。該結果與結構域預測結果相一致，表明大麗輪枝菌11個β-1,4-內切木聚糖酶蛋白中，含有5個糖苷水解酶11家族成員，4個10家族成員和2個43家族成員。

2.4 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因結構分析

利用在線軟件GSDS對獲得的11個β-1, 4-內切木聚糖基因的結構進行分析，結果如圖4所示：VDAG_06165基因外顯子和內含子最多，含有7個外顯子和6個內含子；VDAG_05042和VDAG_08273基因外顯子和內含子較少，分別含有2個外顯子和1個內含子。其余8個基因中，4個基因(VDAG_03385、VDAG_03809、VDAG_04744和VDAG_03808)含有4個外顯子和3個內含子，4個基因(VDAG_05294、VDAG_05043、VDAG_05042和VDAG_05509)含有3個外顯子和2個內含子。

10、11和43分別指糖苷水解酶10、11和43家族

10、11 and 43 refer to glycoside hydrolase families of 10、 11 and 43, respectively

圖3 大麗輪枝菌和其他物種中β-1,4-內切木聚糖酶蛋白進化樹分析
Fig.3 Phylogenetic tree analysis of Endo-β-1,4-xylanase proteins inV.dahliaeand other species

藍色表示UTR(上下游序列),綠色表示編碼區,灰線表示內含子區

The blueindicates UTR, the green indicates the exon, and the gray indicates the intron

圖4 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因結構分析
Fig.4 Gene structures analysis of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliae

2.5 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因的染色體分布

大麗輪枝菌有8條染色體，Chr01長度為 5 243 713 bp，Chr02為5 264 584 bp，Chr03為 5 534 790 bp，Chr04為3 754 323 bp，Chr05為 3 249 347 bp，Chr06為2 537 490 bp，Chr07為 3 147 721bp，Chr08為2 984 914 bp。11個β-1,4-內切木聚糖酶基因分布在其中5條染色體上(圖5)。3號染色體上分布的β-1,4-內切木聚糖酶基因最多，包括VDAG_03790、VDAG_03808、VDAG_03809和VDAG_04744四個基因，它們的基因組序列長度分別為893 bp、1 315 bp、956 bp和1 172 bp。8號染色體上分布的基因最少，僅含VDAG_06165基因，其基因組長度為1 438 bp。2號、4號和6號染色體上分別分布2個基因，VDAG_05294與VDAG_05509分布于2號染色體上，它們的基因組序列大小分別為779 bp和1 118 bp；VDAG_05042和VDAG_05043分布于4號染色體上，它們的基因組序列大小分別為748 bp和806 bp；VDAG_03385和VDAG_08273分布于6號染色體上，它們的基因組序列大小分別為1 645 bp和1 091 bp。根據200 kb的核苷酸中含有3個以上基因即為1個基因簇[26]，3號染色體上的4個基因形成1個基因簇，其他染色體上未形成基因簇。

圖5 大麗輪枝菌β-1,4-內切木聚糖酶基因在染色體上的分布Fig.5 Chromosomal distribution of Endo-β-1,4-xylanase genes in V.dahliae

2.6 β-1,4-內切木聚糖酶基因對不同抗感棉花品種根系分泌物的響應分析

抗病品種根系分泌物對病菌的孢子萌發和菌絲生長有一定的抑制作用，而感病品種根系分泌物則能刺激病菌生長[27-28]。根據不同抗感棉花品種根系分泌物培養6 h和12 h的大麗輪枝菌的轉錄組測序結果，獲得β-1,4-內切木聚糖酶基因培養后每個時間點的FPKM值，用HemI軟件繪制基因在不同抗感棉花根系分泌物中的表達熱圖。根據β-1,4-內切木聚糖酶基因在不同抗感根系分泌物中表達模式的差異(圖6)，11個基因被劃分為3組，第3組基因(VDAG_03790、VDAG_03808、VDAG_03809、VDAG_05043和VDAG_06165)的表達量在感病品種根系分泌物培養的大麗輪枝菌(VDX6和VDX12)中明顯較高，而在耐病品種根系分泌物培養的大麗輪枝菌(VDZ6和VDZ12)和水培養的大麗輪枝菌(VDW6和VDW12)中表達量較低。結合5個基因的FPKM折線圖(圖7)可見，VDAG_03790在感病品種根系分泌物培養6 h的樣本中表達量明顯升高；VDAG_03808在感病品種根系分泌物培養6 h和12 h的樣本中表達量均較高，VDAG_03809、VDAG_05043和VDAG_06165在感病品種根系分泌物培養12 h的樣本中表達量明顯升高。而5個基因在耐病品種根系分泌物和水培養的樣本表達量未見明顯升高。上述分析表明5個基因均對感病品種根系分泌物產生響應，暗示它們與大麗輪枝菌的致病性相關。

紅色和藍色分別代表基因表達水平的高低

Red and blue bands represent high and low gene expression levels, respectively

圖6 β-1,4-內切木聚糖酶基因在不同抗感棉花
根系分泌物培養的大麗輪枝菌中的表達熱圖
Fig.6 Heat map of Endo-β-1,4-xylanase genes
inV.dahliaecultured root exudates
from different resistant cottons

3 結論與討論

糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)亦稱糖苷酶，是作用于各種糖苷或寡糖使糖苷鍵水解的酶的總稱。CAZy(Carbohydrate-Active enzymes Database)數據庫以糖苷水解酶與唯一性底物特異性結合原理，將糖苷水解酶家族分為130個家族[29-30]。內切木聚糖酶主要存在于兩個離散的序列家族第10和11家族[31]。本研究通過對大麗輪枝菌中11個β-1,4-內切木聚糖酶基因進行生物信息學分析發現，5個基因含有Glyco_hydro11結構域，與其他物種中11家族成員聚為一類，屬于糖苷水解酶11家族；4個基因含有Glyco_hydro10結構域，與其他物種中10家族成員聚為一類，屬于10家族；2個基因含有Glyco_hydro43結構域，與其他物種中43家族成員聚為一類，屬于43家族。

蛋白結構域分析還發現VDAG_06165中含有一個fCBD結構域，該結構域被認為存在于大多數真菌纖維素酶和半纖維素酶中[32]。CBD結構域在木聚糖酶降解天然植物細胞壁木聚糖中起著重要的作用[32-33]，它是由33～36個氨基酸組成的具有高度保守性的區域。由于VDAG_06165含有fCBD結構域，推測該基因可能與降解木聚糖有關。VDAG_03808中含有一個CBM結構域，該結構域是碳水化合物結合模塊(CBMS)，通常存在于較長的蛋白質序列中，與碳水化合物活性酶的催化模塊(例如糖苷水解酶和多糖裂合酶)共存，在那里它們可增強酶模塊的催化活性[34]。CBM通過使酶接近纖維素表面來影響酶的活性[30,34]。

VDX表示β-1,4-內切木聚糖酶基因在感病棉花品種根系分泌物中表達量；VDZ表示β-1,4-內切木聚糖酶基因在抗病棉花品種根系分泌物中表達量；VDW表示β-1,4-內切木聚糖酶基因在水培養中表達量

VDX represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with root exudates from susceptible cultivars;VDZ represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with root exudates from tolerance cultivars;VDW represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with water

圖7 β-1,4-內切木聚糖酶基因在不同抗感棉花品種根系分泌物培養的
大麗輪枝菌中FPKM值的變化趨勢圖
Fig.7 Change trend of FPKM value of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliae
cultured with root exudates from different resistant cottons

糖苷水解酶43家族成員均含有Glyco_hydro43結構域，催化果膠降解的果膠酶一般含有該結構域[25]。本研究中VDAG_03808和VDAG_05509均含有糖苷水解酶43家族結構域，推測這兩個基因可能參與果膠的降解。在所有含有糖苷水解酶43主結構域的蛋白質中，69%的蛋白質還含有一個信號肽，將翻譯后的蛋白質導向細胞質外。VDAG_03808中無信號肽；VDAG_05509含有1～19 bp長度分泌信號肽，推測該基因編碼的分泌蛋白在細胞外發揮作用。

根系分泌物是植物根系在生長過程中釋放到介質中的全部有機和無機物質。大麗輪枝菌通過根系入侵棉花，因此根系分泌物的生物學效應對大麗輪枝菌的成功侵染至關重要[28，35-36]。棉花根系分泌物富含氨基酸和糖類，抗病品種和感病品種的根系分泌物成分有明顯差異。與抗病棉花品種根系分泌物相比，感病品種根系分泌物中富含天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和脯氨酸等大量氨基酸，葡萄糖、果糖和蔗糖含量明顯較高[37]。抗病品種根系分泌物抑制大麗輪枝菌的生長，而感病品種根系分泌物促進其生長[22,28]。目前棉花根系分泌物對基因表達的影響研究仍較少，VdRGS1在根系分泌物處理的大麗輪枝菌中的表達量明顯升高，基因敲除和回補試驗發現該基因與大麗輪枝菌孢子生產、菌絲發育、微菌核的形成和致病性相關[13]。本研究分析不同抗感棉花品種根系分泌物對11個β-1,4-內切木聚糖酶基因的表達的影響。

植物病原真菌可以產生一系列細胞壁降解酶，以促進感染和定植，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等。近年來，研究人員已利用基因敲除手段對大麗輪枝菌中細胞壁降解相關基因的功能進行研究，但由于這些基因都是以基因家族的形式存在，導致基因的功能研究未獲得確定性的結果。因此，確定基因家族中對致病性起關鍵作用的基因對于大麗輪枝菌致病分子機制的解析是十分必要的。本研究通過制作11個基因在不同抗感棉花根系分泌物中的表達熱圖和部分基因的表達折線圖，發現5個β-1,4-內切木聚糖酶基因在感病品種根系分泌物培養的大麗輪枝菌中明顯上調，而在耐病品種根系分泌物和水培養的樣本中未明顯上調，表明它們對感病品種的根系分泌物有明顯的響應，暗示它們可能與大麗輪枝菌的致病性相關，這些基因可用作今后利用基因敲除技術研究基因功能與大麗輪枝菌致病分子機制的目標基因。