再生稻根際促生菌的分離、篩選與鑒定

許麗寧 徐敬棋 邵彩虹 吳文革 陳鴻飛 林文雄

摘要：【目的】對再生稻根際土壤開展根際促生菌的分離、篩選與鑒定，為開發和生產促進再生稻腋芽萌發的微生物肥料提供資源和技術支持?！痉椒ā坎捎孟♂尫蛛x法從再生稻根際土壤中分離根際促生菌，以無菌培養基處理為對照，通過盆栽試驗篩選具有促進再生稻腋芽萌發生長作用的根際促生菌，并進行促生菌株的16S rDNA鑒定和促生活性測定?！窘Y果】從再生稻根際土壤中分離獲得4株菌株（ZSD1、ZSD2、ZSD3和ZSD4），革蘭氏染色結果表明，ZSD1菌株為革蘭氏陰性菌，ZSD2、ZSD3和ZSD4菌株為革蘭氏陽性菌。再生稻促生盆栽試驗結果顯示，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有促生能力，與對照相比，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理的再生稻分蘗數分別多61.76%、45.59%和102.94%，單株產量分別為13.17、11.68和16.83 g，分別比對照提高66.08%、47.29%和112.23%，差異達顯著水平（P<0.05），ZSD3菌株的促生效果最佳，其次為ZSD1菌株。促生活性測定結果顯示，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株均具有解磷、解鉀、固氮和產生長素（IAA）的能力，其中解磷和產IAA能力排序為ZSD1菌株>ZSD2菌株>ZSD3菌株，固氮和解鉀能力排序為ZSD3菌株>ZSD1菌株>ZSD2菌株。16S rDNA序列比對結合形態生物學分析結果表明，ZSD1菌株為沙雷氏菌（Serratia），ZSD2菌株為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），ZSD3菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）?！窘Y論】分離篩選出的ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有較強的促進再生稻腋芽生長效應，以ZSD3菌株的促生能力最強，可為今后開發再生稻生物菌肥提供菌種資源。

關鍵詞： 再生稻;根際促生菌;分離篩選;菌株鑒定;促生活性

Abstract：【Objective】In this study，isolation，screening and identification of plant growth-promoting rhizobacteria fromratooning rice were determined，in order to provide resources and technical supports for the development and production of microbial fertilizer to promote the axillary buds germination of ratooning rice. 【Method】The plant growth-promo-ting rhizobacteria were isolated from the? rhizosphere soil fromratooning rice by diluting and separating method. With the aseptic culture medium treatment as control，the plant growth-promoting rhizobacteria which could promote the axillary buds germination fromratooning rice were screened by pot experiment and were identified by 16S rDNA. Additionally，the growth promoting characteristics of plant growth-promoting rhizobacteria of ratooning rice were determined. 【Result】Four strains（ZSD1， ZSD2， ZSD3 and ZSD4） were isolated from the rhizosphere soil of ratooning rice. Gram staining found that ZSD1 strain was gram-negative，ZSD2，ZSD3 and ZSD4 strain were gram-positive bacteria.The results of pot experiment showed that the strains ZSD1，ZSD2 and ZSD3 had the ability of promoting the axillary bud germination of ratooning rice.Compared with the control，the tiller numbers of ratooning rice were 61.76%，45.59%，102.94% higher and the single plant yield were 66.08%，47.29%，112.23% higher in the treatment of ZSD1（13.17 g），ZSD2（11.68 g） and ZSD3（16.83 g） stain，respectively. The differences were significant（P<0.05）. ZSD3 strain had the strongest promoting effect，followed by ZSD1 strain. The assay of growth-promoting activity showed that ZSD1， ZSD2 and ZSD3 strains had the ability of dissolving phosphorus，dissolving potassium， fixing nitrogen and producingauxin（IAA）. The abilities of dissolving phosphorus and producing IAA ranked as ZSD1 strain>ZSD2 strain>ZSD3 strain. The abilities of fixing nitrogen and dissolving potassium ranked as ZSD3 strain> ZSD1 strain> ZSD2 strain. 16S rDNA sequence alignment and morphological analysis showed that ZSD1 strain was Serratia， ZSD2 strain was Lysinibacillus fusiformis and ZSD3 strain was Bacillus amyloliquefaciens. 【Conclusion】The ZSD1，ZSD2 and ZSD3 strains isolated from the rhizosphere soil of ratooning rice have strong effects on promoting the growth of axillary buds in ratooning rice，the promotion effects of ZSD3 is the strongest， which could be used to develop the bio-bacterial fertilizer of ratooning rice.

0 引言

【研究意義】近年來，隨著水稻種植面積的不斷減少及單產增長率的逐年下降，再生稻已成為種植一季稻熱量有余而雙季稻熱量不足地區及雙季稻改為單季稻地區提高水稻復種指數、增加稻田有效面積和稻谷產量的有效措施（楊東等，2007）。有研究表明單位面積再生分蘗數對再生稻產量貢獻度最大（楊惠杰等，2005），當前，提高再生稻分蘗數主要依賴化肥的施用，但長期大量施用化肥不僅會導致農田生態環境、土壤理化性狀及微生物群落受到不同程度破壞，還會促使作物病蟲害增多（劉正柱，2004），增加生產成本。為了克服使用化肥的諸多負面影響，科研人員已在多種作物上開展以生物菌肥部分替代化肥的相關研究，并獲得良好效果（王豹祥等，2011;常梅，2013;何志剛等，2013;榮良燕等，2014;張志鵬等，2019）。因此，分離篩選能促進再生稻分蘗數的植物根際促生菌，以此為基礎生產能部分替代化肥以減少化肥施用量的微生菌肥具有重要意義。【前人研究進展】植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指能在植物根際定殖，可使土壤中某些無效元素有效化、合成某些物質和（或）抑制或減輕某些植物病害從而促進植物生長的有益菌類（崔曉雙等，2015），研究人員已在多種作物上分離篩選到PGPR。在經濟作物上，榮良燕等（2011）篩選出PGPR菌株191和LHSⅡ，其對黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌和立枯絲核菌均具有良好的抑制效果;羅靜靜（2015）從棉田中篩選得到的2株枯草芽孢桿菌能有效防治棉花連作障礙;李想等（2017）從煙草根際篩選得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，其均具有廣譜抗菌作用。在糧食作物上，王平等（1999）從小麥根圈細菌中篩選得到7株對小麥根腐病原菌及5株對小麥全蝕病原菌有抑制作用的PGPR菌株;焦峰等（2005）發現PGPR與化肥配合施用，能提高水稻的株高、根系活力、穗數、穗粒數和千粒重，較單施化肥增產26.0%;胡雪（2010）從水稻根際分離得到4株能提高水稻生物量和1株有效防治稻瘟病及紋枯病的PGPR菌株;劉澤平等（2018）從水稻根際土壤分離純化得到3株具有較強促生能力的促生菌（Bacillus megaterium LZP03、B. huizhouensis LZP05和B. subtilis LZP06）。【本研究切入點】雖然已在水稻和多種作物上分離篩選出具有促生和（或）生防功能的PGPR，但目前可用于促進再生稻腋芽萌發生長的PGPR鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】從再生稻根際土壤中分離、篩選、鑒定PGPR并測定其促生能力，以期為開發和生產促進再生稻腋芽萌發的微生物肥料提供資源和技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

水稻品種甬優2640購自福州農豐源種業有限公司，LB培養基、固氮液體培養基、解磷液體培養基、解鉀液體培養基、瓊脂粉、胰蛋白胨和氯化鈉等試劑均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

LB培養基：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，氯化鈉10.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.4;固氮液體培養基：葡萄糖10.00 g，磷酸氫二鉀0.20 g，硫酸鎂0.20 g，氯化鈉0.20 g，硫酸鈣0.20 g，碳酸鈣5.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2;解磷液體培養基：葡萄糖10.00 g，硫酸銨0.50 g，氯化鉀0.30 g，氯化鈉0.30 g，硫酸鎂0.30 g，硫酸錳0.03 g，硫酸亞鐵0.03 g，磷酸三鈣8.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5;解鉀液體培養基：蔗糖5.00 g，氯化鐵0.005 g，硫酸鎂0.50 g，碳酸鈣0.10 g，磷酸氫二鈉2.00 g，鉀長石粉2.00 g，pH 7.0～7.5。

1. 2 PGPR分離與純化

于2016年9月采用五點采樣法從福建農林大學教學基地試驗田采集具有強再生力水稻品種甬優2640再生季根際土樣，混勻作樣品，采用稀釋分離法對土樣微生物進行分離純化;稱取10 g土壤置于三角瓶中，加入90 mL無菌水，120 r/min振蕩30 min，獲得土壤懸液，將其依次稀釋，制成10-1～10-6不同稀釋度的土壤懸液;取10-3～10-6各稀釋梯度樣品0.1 mL涂抹于LB固體培養基上，每個濃度重復3次，培養基倒置于30 ℃培養箱培養1 d后，選取菌落數適宜的平板挑取單菌落，采用平行劃線方法進行純化，連續劃線分離3次，確認為純化的細菌。

1. 3 PGPR篩選及促生效果測定

PGPR篩選及促生效果試驗采用桶栽法，將分離得到的菌株接種至LB液體培養基中，34 ℃、220 r/min振蕩培養48 h，得到濃度為106～108 CFU/mL的菌株發酵液;桶栽塑料桶上口徑30 cm、下口徑23 cm、高30 cm，每桶裝土12 kg，桶栽3株，每個菌處理和對照各6桶，3次重復，收割后3 d開始處理，處理時不施用化肥，只用濃度為106～108 CFU/mL菌株發酵液灌根，每桶澆灌菌株發酵液500 mL，隔3 d再澆灌1次，共2次，以強化菌在根際的定殖;對照澆灌相同體積的無菌培養基，處理方法相同。澆入后每隔7 d記錄1次再生分蘗數的變化，于再生稻成熟期，每處理取3株考察單株穗數、穗粒數、結實率、千粒重和單株產量。

1. 4 菌株鑒定

1. 4. 1 形態學鑒定 將分離篩選得到的菌株接種在劃線的LB固體培養基上，28 ℃培養24 h，觀察菌落顏色、形狀、透明度及表面邊緣隆起程度等性狀，并進行革蘭氏染色觀察。

1. 4. 2 分子生物學鑒定 采用細菌基因組提取試劑盒OMEGA D3350-01[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取篩選得到的菌株基因組總DNA，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系：10×Taq Buffer 5 ?L，dNTP 1 ?L，引物2 ?L，TaqDNA聚合酶1 ?L，模板2 ?L，ddH2O補足至50 ?L。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min（屈青松等，2016）。用1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統Gel Doc XR+（美國伯樂公司）觀測擴增結果，將PCR擴增產物送至鉑尚生物技術（上海）有限公司測序，所得16S rDNA序列與NCBI數據庫進行同源性比對，利用MEGA 5.0的鄰接法構建系統發育進化樹，進行遺傳進化分析。

1. 5 促生活性測定

將分離得到的菌株分別接種于盛有LB液體培養基的試管中過夜活化，得到活化菌株。

將1 mL活化菌株接種于50 mL經滅菌含有L-色氨酸的LB液體培養基中，以不接種為空白對照，接種后28 ℃、150 r/min振蕩培養7 d，取1 mL上清液加入2 mL Salkowski反應液，混勻后，于室溫下暗處反應30 min，采用紫外分光光度計UV-1900[翱藝儀器（上海）有限公司]測定OD530（張東艷等，2016），計算產生長素（IAA）量。

將1 mL活化菌株接種于50 mL經滅菌的解磷液體培養基中，以不接種為空白對照，接種后28 ℃、150 r/min振蕩培養7 d，采用鉬藍比色法測定解磷量（馬驄毓等，2016）。

將1 mL活化菌株接種于50 mL經滅菌的解鉀液體培養基中，以不接種為空白對照，接種后28 ℃、150 r/min振蕩培養7 d，取10 mL菌液10000 r/min離心10 min后，取上清液采用火焰分光光度計FP6410（上海儀電分析儀器有限公司）測定解鉀量（鮑士旦，2000）。

將1 mL活化菌株接種于50 mL經滅菌的固氮液體培養基中，以不接種為空白對照，接種后28 ℃、150 r/min振蕩培養7 d，取10 mL菌液10000 r/min離心10 min后，取上清液采用凱氏定氮儀KDN-08A（上海昕瑞儀器儀表有限公司）測定固氮量（鮑士旦，2000）。

1. 6 統計分析

采用Excel 2013和DPS v14.10進行數據整理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 菌株分離純化結果

在LB固體培養基上通過平行劃線方法進行菌株分離純化，得到4株菌株，分別編號為ZSD1、ZSD2、ZSD3和ZSD4。4株菌株的菌落形態見表1，ZSD1、ZSD2和ZSD4菌株的菌落基本形態特征均為圓形，淡黃色，邊緣整齊，表面突起濕潤;ZSD3菌株的菌落基本形態特征為圓形，乳白色，邊緣不整齊，表面扁平粗糙。

進一步對4株菌株進行革蘭氏染色鏡檢，由圖1可知，ZSD1菌株革蘭氏染色呈紅色，屬于革蘭氏陰性菌（G-）;ZSD2、ZSD3和ZSD4菌株革蘭氏染色呈紫色，屬于革蘭氏陽性菌（G+）。

2. 2 PGPR菌株的篩選及促生效果測定結果

盆栽促生結果如圖2和表2所示。由圖2可知，與對照相比，在澆入菌株發酵液后的14 d內，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理的再生稻分蘗數呈快速增長趨勢，之后增長速度變緩，至澆入菌株發酵液后第35 d，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理的再生稻分蘗數分別比對照多61.76%、45.59%和102.94%，差異達顯著水平（P<0.05，下同），ZSD4菌株處理的再生稻分蘗數與對照無顯著差異（P>0.05，下同），表明ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有較強的促進再生稻腋芽萌發成蘗能力。

由表2可知，再生稻成熟期ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理的單株產量分別為13.17、11.68和16.83 g，分別比對照顯著提高66.08%、47.29%和112.23%，而ZSD4菌株處理的單株產量較對照顯著減少13.49%，ZSD3菌株處理的單株產量顯著高于ZSD1、ZSD2和ZSD4菌株處理。從產量構成因子（表2）來看，與對照相比，再生稻成熟期ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理間的每穗粒數、千粒重和結實率差異均不顯著，造成產量差異的主要因子是單株穗數，ZSD3菌株處理的再生稻單株穗數顯著多于ZSD1和ZSD2菌株。可見，分離篩選得到的ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株均具有促進再生稻腋芽萌發成蘗的能力，促生能力依次為ZSD3菌株>ZSD1菌株>ZSD2菌株，而ZSD4菌株無促生效果。

2. 3 菌株促生活性測定結果

由表3菌株促生活性測定結果可知，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株均具有解磷、解鉀、固氮和產IAA的能力，但3株菌株有所不同。解磷和產IAA能力由高到低排序為ZSD1菌株>ZSD2菌株>ZSD3菌株，ZSD1菌株的解磷能力較ZSD2和ZSD3菌株分別高22.77%和226.51%，產IAA能力比ZSD2菌株高109.88%，是ZSD3菌株的24.95倍，差異均達顯著水平。固氮和解鉀能力由高到低排序為ZSD3菌株>ZSD1菌株>ZSD2菌株，ZSD3菌株的解鉀能力較ZSD1和ZSD2菌株分別高78.47%和423.10%，固氮能力較ZSD1和ZSD2菌株分別高43.60%和160.22%，差異均達顯著水平。

2. 4 PGPR菌株鑒定

將菌株16S rDNA測序結果與NCBI上GenBank數據庫進行同源性比對，經BLAST比對分析發現，ZSD1菌株16S rDNA序列與Serratia sp. strain N1SM32的同源性達99.93%，ZSD2菌株16S rDNA序列與Lysinibacillus fusiformis strain RB-21的同源性達99.86%，ZSD3菌株16S rDNA序列與B. amyloli-quefaciens subsp. SDF002的同源性達100.00%?；?6S rDNA序列同源性構建的系統發育進化樹分析（圖3）顯示，ZSD1菌株與Serratia聚為一支，ZSD2菌株與L. fusiformis聚為一支，ZSD3菌株與B. amyloliquefaciens聚為一支，將分子生物學鑒定與上述菌落形態結構和菌株革蘭氏染色結果結合，可確定ZSD1菌株為沙雷氏菌（Serratia），ZSD2菌株為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（L. fusiformis），ZSD3菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

3 討論

近年來，PGPR微生物菌肥在多種作物化肥減施增產上表現出良好的應用效果（榮良燕等，2011;羅靜靜，2015;李想等，2017;曹媛媛等，2019）。在水稻上，梁運江等（2001）研究發現在減少50%化肥的基礎上配施生物菌肥能使水稻增產74%;葉喜文等（2005）研究發現PGPR促生菌肥在水稻上施用，分蘗末期每平方米分蘗數較單施化學肥料處理平均增加20個，增產26%;de Salamone等（2012）在水稻大田條件下聯合使用熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense），可使水稻收獲指數和產量提高16.0%和20.2%;Pham等（2017）發現在盆栽條件下接種斯氏假單胞菌（P. stutzeri）A15可使水稻苗和根的干重顯著提高。本研究的再生稻盆栽促生試驗結果表明，與對照相比，澆入ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株發酵液后35 d，再生稻分蘗數分別增加61.76%、45.59%和102.94%，單株產量分別提高66.08%、47.29%和112.23%，差異達顯著水平。從產量構成因子來看，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株處理再生稻產量提高的主要原因是促進再生分蘗數，劉愛中等（2008）研究表明影響再生稻產量最主要的因子是有效穗數，而有效穗數均來自再生苗;從再生稻有效穗數來看，具有促生功能的3株菌株在促生效果上有所不同，以ZSD3菌株的促生能力最強，顯著強于ZSD1和ZSD2菌株。由此可見，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株的促生主要是通過促進腋芽萌發、增加再生稻分蘗數來提高再生稻產量。

PGPR最早在馬鈴薯上分離發現，迄今為止，國內外研究者從各種植物根際分離篩選獲得大量具有植物促生和生防作用的PGPR，主要種類有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）及伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等20多個種屬（王彪等，2019）。本研究篩選得到的ZSD1菌株屬于沙雷氏菌，ZSD2菌株屬于紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，ZSD3菌株屬于解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌屬和沙雷氏菌屬在促進植物生長和生防作用上已有較多研究報道，而紡錘形賴氨酸芽孢桿菌較多見于環境修復和生防方面的報道，在促進植物生長方面的報道相對較少（Vendan et al.，2010;Trivedi et al.，2011;Singh et al.，2013）。PGPR促進植物生長的機理可分為直接作用和間接作用，其中，直接作用是指PGPR可使土壤中某些無效元素有效化或合成某些物質（固氮、溶鉀、溶磷和產IAA等），從而促進植物生長;間接作用是指有些PGPR可抑制或減輕某些植物病害的發生，并通過誘導植物系統抗性以提高植物自身對疾病的防衛機制，從而降低對植物生長發育及產量收獲的不良影響（田婧等，2016）。從菌株的促生活性可知，本研究分離篩選得到的沙雷氏菌、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌均具有解磷、解鉀、固氮和產IAA能力。氮、磷、鉀是再生稻腋芽萌發生長所必需的大量元素;同時，氮和磷還是信號物質，氮經硝化作用形成的硝態氮作為信號分子可激活一系列基因表達和內源激素（細胞分裂素）;土壤中磷含量增加可抑制根中獨角金內酯的合成，而獨角金內酯會抑制作物分枝的發生?？梢?，ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有的解磷、解鉀和固氮能力可為再生稻腋芽萌發生長提供營養，還可能是腋芽解除休眠的信號因子，但具體原理有待進一步研究。此外，這3株菌株具有產IAA能力，土壤中低濃度IAA可促進根系生長，林文等（2001）研究表明再生稻腋芽萌發與根系機能有著顯著的相關性，即這3株菌株具有的產IAA能力還可通過促進再生稻根系生長進而促進腋芽萌發生長。本研究結果還表明，3株菌株的固氮、解磷、解鉀和產IAA能力不同，解磷和產IAA能力從高到低排序為ZSD1菌株>ZSD2菌株>ZSD3菌株;固氮和解鉀能力從高到低順序為ZSD3菌株>ZSD1菌株>ZSD2菌株，且盆栽促生結果顯示，ZSD3菌株的促生能力最強，顯著強于ZSD1和ZSD2菌株，可推斷ZSD3菌株比ZSD1和ZSD2菌株具有更強的固氮、解鉀能力可能是ZSD3菌株處理再生稻產量高于ZSD1和ZSD2菌株的原因，其具體促生機制有待進一步探討。

4 結論

本研究從再生稻根際土壤中分離得到4株菌株（ZSD1、ZSD2、ZSD3和ZSD4），通過再生稻促生盆栽試驗，篩選出3株具有高效促進再生稻腋芽萌發分蘗的PGPR菌株（ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株），以ZSD3菌株的促生效果最強，其次為ZSD1菌株，可為今后開發再生稻生物菌肥提供菌種資源。

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（責任編輯 羅 麗）